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1、待测菌株革兰氏染色 + 杆菌 球菌 运动性+ 细胞色素氧化酶 氧化发酵试验 + O/ 发酵 F 细胞色素氧化酶 氧化发酵试验 棒杆菌属 微球菌属 氧化 O芽孢杆菌属 葡萄球菌属 莫拉氏菌属/不动杆菌属 + 细胞色素氧化酶 氧化发酵试验 氧化发酵试验 发酵 F +肠杆菌科 不动杆菌属 黄杆菌属 氧化 O 发酵生长需钠试验 假单胞菌属 产碱菌属 + 弧菌属 气单胞菌属图图 1 分离菌株鉴定程序分离菌株鉴定程序 4.新型微生态制剂展望微生态制剂主要成分来自土壤、粪便、机体肠道以及水体，是一种天然的产品，因无 再污染、成本低、收效大等优点而具有广阔的开发价值和应用前景。目前微生态制剂的应 用尚起步，主
2、要存在的问题是加工处理后稳定性差、细菌易活、利用效果低，还应加强基 础方面的研究。今后开发中应注意制剂的质量问题，更要注重它对实际生产的真实效用， 其次要注意菌种的筛选，研究不同菌株的配比效果以及菌剂的保存期等。未来社会需要养 殖业应用生态性健康养殖模式”生产绿色产品，微生态制剂作为绿色产品或绿色药物起 到抗生素的替代品和补充品，有人预言“光辉的抗生素之后，是微生态制剂的崭新时代” ， 因此微生态制剂开发和应用将具有广阔的市场前景。采用革兰氏染色、芽胞染色、过氧化氢酶测定、氧化酶测定、甲基红试验、VO.P 试验、吲 哚试验、硫化氢试验、柠檬酸盐利用试验、脲酶测定试验、葡萄糖产气试验、甘露醇产酸
3、 试验、乳糖产酸试验、动力试验,具体操作过程参照 5 伯杰细菌鉴定手册3、液体培养基接种 液体培养基接种主要用于微生物的增菌培养。 （1）用灭菌的接种环挑取细菌菌种迅速移到肉汤培养基管，涂于接近液面的倾斜的管 壁上，并轻轻研磨，再直立试管，菌种即溶于肉汤中。 （2）灼烧接种环，放回原处。两试管口经火焰灭菌后塞上棉塞。 （3）在斜面管口写明菌种名称、日期，直立于 37恒温培养 24 小时，进行观察。 培养基 4、甲基红（、甲基红（Methyl Red）试验（）试验（MR 实验）实验）肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中， 由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀
4、酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基 PH 值下降至 pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红。试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于 MRVP 生化鉴定管，于 36 通用培养 基，培养于 361C 或 30C（以 30C 较好）35 天，从第二天起，每日取培养液 1ml， 加甲基红指示剂 12 滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或 至第 5 天仍为阴性、即可判定结果。甲基红为酸性指示剂，pH 范围为 4.46.0，其 pK 值为 5.0。故在 pH5.0 以下，随酸度 而增强黄色，在 pH5.0 以上，则随碱度而增强黄色，在 pH5.0 或上下接近时，可能变色不
5、够明显，此时应延长培养时间，重复试验。5 5、V-PV-P 试验试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成 乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基 生成红色化合物，称 VP（+）反应。试验方法：）OMeara 氏法：将试验菌接种于通用培养基，于 361C 培养 48h，培养液 1ml 加 OMeara 试剂（加有 0.3%肌酸 Creatine 或肌酸酐 Creatinine 的 40%氢氧化钠水溶液） 1ml，摇动试管 12min，静置于室温或 361C 恒温箱，若 4h 内不呈现伊红、即判定为阴 性。亦有主张在 4
6、850C 水浴放置 2h 后判定结果者。）Barritt 氏法：将试验菌接种于通用培养基，于 361C 培养 4 天、培养液 2.5ml 先加入 5C 萘酚（2-na-phthol）纯酒精溶液 0.6ml,再加 40%氢氧化钾水溶液 0.2ml，摇动 25min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或 361C 恒 温箱，如 2h 内仍不显现红色、可判定为阴性。）快速法：将 0.5%肌酸溶液 2 滴放于小试管中、挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培 养物一接种环，乳化接种于其中，加入 5%-萘酚 3 滴，40%氢氧化钠水溶液 2 滴，振动后 放置 5min，判定结果。不产酸的培养物不能使用
7、。本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌等其它细菌时， 通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。32、在 pH5.7 营养肉汤上的生长本试验应用于芽孢杆菌属中种的鉴定。接种和观察结果：取菌液一环，接种于上述培养基中，同时接种普通肉汤液（7.2pH）作对照。适温培养 13d 后观察生长情况。该培养液要求十分澄清，pH 必须准确，最好用 pH 计调测。7 7、葡萄糖的氧化发酵试验、葡萄糖的氧化发酵试验在细菌鉴定中，糖类发酵产酸是 1 项重要依据。细菌对糖类的利用有 2 种类型：1 种 是从糖类发酵产酸，不需要以分子氧作为最终受氢体，称发酵型产酸；另
8、一种则以分子氧 作为最终受氢体，称氧化型产酸。前者包括的菌种类型为多数。氧化型产酸量较少，所产 生的酸常常被培养基中的蛋白胨分解时所产生的胺所中和，而不表现产酸。为此，Hugh 和 Leifson 提出一种含有低有机氮的培养基，用以鉴定细菌从糖类产酸是属氧化型产酸或发酵 型产酸。这一试验广泛用于细菌鉴定。一般用葡萄糖作为糖类代表。也可利用这一基础培 养基来测定细菌从其他糖类或醇类产酸的能力。（1）接种 ：以 1824h 的幼龄菌种，穿刺接种在上述培养基中，每株菌接 4 管，其 中 2 管用油封盖（凡士林：液体石蜡1：1 混合后灭菌），约加 0.51 厘米厚，以 隔绝空气为闭管。另 2 管不封油
9、为开管，同时还要有不接种的闭管作对照。适温培养 1、2、4、7 天观察结果。（2）结果观察：氧化型产酸仅开管产酸，氧化作用弱的菌株往往先在上部产碱 （12d），后来才稍变酸。发酵型产酸则开管及闭管均产酸，如产气，则在琼脂柱 内产生气泡。8 8、糖或醇类发酵试验、糖或醇类发酵试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利用者，或产 气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基管， 若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置 361.0C 培养，每天观察结果， 检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无
10、气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半 固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力， 若有动力、培养物可呈弥散生长。本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别， 因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和 An- drade 指示剂。注：对于糖醇类发酵现在一般用糖、醇类细菌微量生化鉴定管在 361824h 即可出 结果。9 伊红美蓝琼脂(EMB)蛋白胨 10g 乳糖 10g磷酸氢二钾 2g 琼脂 17g2%伊红 Y 溶液 20mL 0.65%美蓝溶液 10mL蒸馏水 1000mL pH7.1制法将
11、蛋白胨、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正 PH，分装于烧瓶内，121高压灭菌 1 5min 备用。临用时加入乳糖并加热溶化琼脂，冷至 5055，加入伊红和美蓝溶液，摇匀 ，倾注平板。为弱选择培养基，供分离肠道致病菌用，伊红与美蓝在培养基中起指示剂作用，分解乳 糖的细菌（如大肠埃希菌），菌落呈紫黑色或紫红色，具有金属光泽；不分解乳糖的细菌 ，菌落为无色。十 肉汤培养基1. 成分：牛肉膏：5 克蛋白胨：10 克NaCL : 5 克蒸馏水：1000ml 2. 制法 （1） 于 1000 ml 水中加入上列成分，混合加热溶解。（2）调 pH 值至 7.27.4 （3）分装，灭菌。 加入琼脂 1520 克，为固体培养基；加入 0.5%琼脂，为半固体培养基。
