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1、苏州大学硕士学位论文T淋巴细胞衰老与老年人非小细胞肺癌的相关性研究姓名：潘旭东申请学位级别：硕士专业：内科学（呼吸病学）指导教师：王翎20090501T 淋巴细胞衰老与老年人非小细胞肺癌的相关性研究中文摘要T 淋巴细胞衰老与老年人非小细胞肺癌的相关性研究中文摘要目的：探讨T 淋巴细胞表面分子C D 2 8 、C D 9 5 增龄性变化与老年人原发性非小细胞肺癌发生发展之间的内在联系及相关机制。方法：应用五色免疫荧光标记流式细胞术和荧光定量实时聚合酶链反应法，对6 3 例老年非小细胞肺癌患者( 老年肺癌组) 的外周血T 淋巴细胞亚群数量以及表面分子C D 2 8 、C D 9 5 的蛋白表达率和
2、m R N A 含量进行检测，结果分别与老年健康组、老年肺良性病变组( 老年非癌组) 、年轻健康组、年轻肺良性病变组( 年轻非癌组)以及年轻肺癌组进行对比分析，同时研究这些免疫指标与老年肺癌生物学行为之间的关系。结果：1 方差分析显示，老年肺癌组外周血中T 细胞亚群C D 2 8 的蛋白表达率及m R N A含量均显著低于其余各组( 尸 7 0 m m o l L 或正接受降糖药物治疗) ，体重指数 2 5 ，外周、，t L , 脏及脑血管动脉粥样硬化性疾病( 由病史、临床表现及相关检查而确诊) ，感染，肝功能或肾功能不全，输血、吸毒史，最近一月内使用过糖皮质激素或免疫抑制剂。二、主要实验仪器
3、与试剂1 主要仪器1 1 8 0 低温冰箱( S a n y o 公司) ；1 2G R P 9 1 6 0 型隔水式恒温培养箱( 上海民仪电子有限公司) ；1 3 瑞江R J L DI IB 低速大容量多管离心机( 无锡市瑞江分析仪器有限公司) ；1 4J o u a nM 砌8 2 2 高速冷冻离心机( 法国J o u a n 公司) ；1 5E p i c s A l t r a 型流式细胞仪( 美国B e c k m a nC o u l t e r 公司) ；1 6T h e r m oS p e c t r o n i c 紫外分光光度计( 美国S p e c t r o n i
4、c 公司) ；1 7G e n eA m pP C RS y s t e m9 7 0 0 扩增仪( 美国应用生物系统公司) ：T 淋巴细胞衰老与老年人t 1 ：4 , 细胞肺癌的相关性研究对象与方法1 8L i g h tC y c l e rR e a lT i m eP C R 扩增仪( R o c h eD i a g n o s t i c s 公司) 。2 药品与试剂2 1藻红蛋白得克萨斯红标记的抗人C D 3 单克隆抗体( a n t i C D 3 E C D ) ( 美国B e c k m a n C o u l t e r 公司) ；2 2藻红蛋白花青苷5 标记的抗人C D
5、 4B e c k m a n C o u l t e r 公司) ；2 3藻红蛋白花青苷7 标记的抗人C D 8B e c k m a n C o u l t e r 公司) ；单克隆抗体( a n t i C D 4 P C 5 ) ( 美国单克隆抗体( a n t i C D 8 P C 7 ) ( 美国2 4 异硫氰酸荧光素标记的抗人C D 9 5 单克隆抗体( a n t i C D 9 5 F I T C ) 及鼠抗人I g G l F I T C ( 美国B e c k m a n C o u l t e r 公司) ；2 5 藻红蛋白标记的抗人C D 2 8 单克隆抗体( a
6、n t i C D 2 8 P E ) 及鼠抗人I g G l P E ( 美国B e c k m a n C o u l t e r 公司) ：2 6F i c o l l 淋巴细胞分离液( 上海恒信化学试剂有限公司) ；2 7T r i z o l ( T a K 出a 公司) ；2 8R N A i s oR e a g e n t 、5 x R e v e r s eT r a n s c r i p t a s eM - M L VB u f f e 、D T T 、R N A s a f e 、d N T PM i x t u r e ，R a n d o m6 m e r s ，
7、R e v e r s eT r a n s c r i p t a s eM M L V ，10 x T a qR e a c t i o nB u f f e r ，R n a s eF r e ed d H 2 0 凝胶回收纯化D N A 试剂盒、P M D l 8 TV e c t o r 试剂盒、质粒D N A 小量纯化试剂盒、S Y B RP r e m i xE xT a q T M 试剂盒、E c o l iC o m p e t e n tJ M l 0 9感受态细胞( 大连宝生物工程有限公司) ；2 9X G a l 、I P T G ( 南京基天生物有限公司) 。三、实验
8、方法1 标本收集和保存所有患者均于住院后次日晨空腹采血，体检者于体检当日晨空腹抽取外周血3m l ，以乙二胺四乙酸钾( E D T A K 2 ) 抗凝，其中1m l 用于T 细胞亚群数量及C D 2 8 、C D 9 5蛋白表达水平的测定。另外2m l 先用等量0 9 N a C I 溶液稀释吹匀，取无菌6m l 试管，加入适量F i c o l l 淋巴细胞分离液，再将稀释的全血标本轻轻铺在F i c o l l 淋巴细胞分层液上，形成清晰的界面，稀释的血标本与淋巴细胞分层液之间的体积比为2 ：1 ；将试管装入高速水平离心机( 2 0 0 0r m i n ) 离, I ) 2 0m i
9、n ；用毛细吸管轻轻将试管内白膜层( 单个核细胞层) 吸出，加入5 倍体积的H a n k s 溶液洗涤2 次( 每次2 0 0 0r m i n ，1 0m i n ) ，再加入0 9 N a C I 溶液洗涤1 次( 2 0 0 0r m i n ，1 0m i n ) ，获取外周血单个核细胞( P B M C ) ，4T 淋巴细胞衰老与老年人非小细胞肺癌的相关性研究对象与方法加入1m lR N A i s oR e a g e n t 后- 8 0 “ C 保存备用，待澳t C D 2 8m R N A 及C D 9 5m R N A 含量。2 T 细胞亚群数量及C D 2 8 、C D
10、 9 5 蛋白表达率的测定取2 支专用试管，各加入抗凝全血1 0 0p l ，各加入抗凝全血1 0 0 山，其中一管加入a n t i C D 3 - E C D 、a n t i C D 4 - P C 5 、a n t i C D 8 - P C 7 、a n t i - C D 9 5 F I T C 、a n t i C D 2 8 一P E 各10 山，另一管i 1 1 ：I , Ka n t i C D 3 一E C D 、a n t i C D 4 P C 5 、a n t i C D 8 P C 7 以及鼠抗人I g G1 一F I T C 、I g G l 一P E 各1 0
11、p l 作同型对照，室温孵育1 5m i n 后力n s o o “l 溶血素，1 5m i n 后离心弃去上清，加0 5 1 0m lP B S 液稀释，混匀后通过流式细胞仪( F C M ) 检测，配套软件取数和分析，每个样本分析100 0 0 个细胞，结果以阳性细胞百分率( ) 表示，所有样品需在6h 内检测完毕。3 外周血中C D 2 8 及C D 9 5m R N A 含量的测定3 1 引物的设计与合成根据G e n eB a n k 提供的C D 2 8 C D 9 5m R N A 序列和p a c t i n 序列，由宝生物工程有限公司设计合成引物，并在P u b m e d
12、上校验其准确性。C D 2 8 引物序列：( 上游)5 - C C G C A T T G T C G T A C G C T A C A A G 3 ，( 下游) 5 - C T A G C C C A T C G T C A G G A C AA A G A 3 ；C D 9 5 引物序列为：( 上游) 5 一G G G A A G C G G T l r A C G A G T G 3 ，( 下游)5 - G G T A G G A G G G T C C A G A T G C 3 ；1 3 - a c t i n 引物序歹0 ：( 上游) 5 - T G G C A C C C AG
13、 C A C A A T G A A 3 ，( 下游) 5 一C T A A G T C A T A G T C C G C C T A G A A G C A 3 。3 2 总R N A 的提取T r i z o l 法提取P B M C 中总R N A ( 参照T a K a R a 公司使用说明) 。1 5 琼脂糖凝胶电泳检测D N A 完整性，可见明亮的2 8 S 、18 S 及较淡5 S = 条带；紫外分光光度计测定R N A浓度及纯度，要求A 2 6 0 A 2 8 0 = l 。8 2 0 ；所提取的R N A 溶于3 0 9 lD E P C 水中直接逆转录后8 0 保存备用。
14、3 3c D N A 的合成反应体系( 4 0u 1 ) ：5 x R e v e r S eT r a n s c r i p t a s eM M L VB u f f e r8g l 、O 1 m o l LD T T1 “l 、d N T PM i x t u r e ( 各10m M ) 2g l 、R a n d o m6 m e r s ( 8 0g m o l L ) 2g l 、R e v e r s eT r a n s c r i p t a s eM M L V ( E x S c f i p tR t a s e ) ( 2 0 0u u 1 ) 1 肛l 、R N
15、A s a f e ( 2 0 x ) 1p 1 、R n a s eF r e ed d H 2 02 3m ，加入T o t a lR N A2p l ，4 2 “ C6 0m i n 、9 5 “ C5m i n 、4 “ Clm i n ，在G e n eA m pP C RS y s t e m9 7 0 0 上合成的c D N A 2 0 “ ( 2 保存或直接P C R 扩增。5T 淋巴细胞衰老与老年人非小细胞肺癌的相关性研究对象与方法3 4 目的基因片段的扩增反应体系( 5 0p 1 ) ：c D N A ( P B M C ) 1r t l ，C D 2 8 或C D 9 5
16、 或p a c t i n 弓I 物2r t l ，1 0 x T a qR e a c t i o nB u f f e r5g l ，d N T PM i x t u r e4m ，T a qD N AP o l y m e r a s e ( 5u r t l ) O 2 5m ，d d H 2 0( 灭菌蒸馏水) 3 7 7 5p l ；反应条件：9 4 预变性3m i n ，9 4 1 5 s ，5 5 3 0 s ，7 2 。C4 0 s ，共4 0 个循环，最后7 2 延伸1 0m i n ；P C R 产物用2 的琼脂糖板上样电泳。3 5 标准品的制备分别取上述扩增的基因片段，经电泳回收纯化，其P C R 产物与P M D l 8 T 载体4 连接过夜，连接产物转化感受态细胞J M l 0 9 涂布于含X
