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1、基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达【教学目录与学时分配】4.1 基因的表达系统与表达策略(0.5)4.2 基因在大肠杆菌中的高效表达(2)4.2.1 基于 T7 噬菌体 RNA 聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统4.2.2 蛋白质的融合表达4.2.3 蛋白质的分泌型表达4.2.4 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性4.3 基因在酵母中的高效表达(1.5)4.3.1 酵母表达系统概述4.3.2 甲醇酵母表达系统4.3.3 组织纤溶酶原激活剂在甲醇酵母中的表达【教学目的】让学生掌握基因表达系统的概念，基因在大肠杆菌与酵母中的高效表达策略，基因高效表达的实例。【教学重点】
2、基因在大肠杆菌高效表达的策略和方式。【教学难点】基因在酵母中的高效表达。【教学方式】多媒体讲解结合启发讨论式教学【教学过程与内容】第一节 基因的表达系统与表达策略（0.5）一、 基因的表达系统基因的表达即有目的的合成目的基因的产物。包括转录、翻译、加工等过程。表达载体：将目的基因在人工控制下置于生物宿主中大量生产。表达载体的三个系统:1 DNA 复制及质粒 DNA 的筛选: 有多克隆位点，有 DNA 复制起点 ori, 及 Amp, Tet 抗性基因2 目的基因的转录的调控序列:这一系统包括启动子,抑制物基因和转录终止子.启动子位于目的基因的上游,常用的如 Placz等.3 蛋白质的翻译:包括
3、核糖体识别位点 SD,翻译起始密码子和终止密码子.（一）大肠杆菌表达系统一个好的大肠杆菌表达系统应该满足的条件：尽可能低的诱导前泄漏表达；快速简便的诱导方式；能够高表达多种基因；易于进行克隆操作；能直接进行点突变和 DNA 序列分析而不要亚克隆，从而满足蛋白质工程研究的需要。优点：操作简便，产量高，成本低。缺点：表达产物缺乏翻译后加工，得到的蛋白质可能缺乏某些天然蛋白所具有的活性。（二）酵母表达系统优点：易培养，繁殖快，便于基因操作缺点：缺乏强有力的受严格调控的启动子，分泌效率低，尤其是对于分子质量大于 30KD 的目的蛋白分子几乎不分泌。不适于高密度培养。甲醇酵母表达系统：具有翻译后加工的功
4、能，有适合真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统。还能分泌目的基因产物导培养液中，有利于纯化等。二、 根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1. 用于生物化学和分子生物学研究： 重点考虑如何保持蛋白质原有的功能2. 表达蛋白用作抗原：合成天然蛋白及表达融合蛋白的策略。3. 用于蛋白质结构研究：形成可溶性蛋白质。第二节 基因在大肠杆菌中的高效表达（2）一、 基于 T7 噬菌体 RNA 聚合酶/启动子的大肠杆菌表达系统优点：1）T7 噬菌体 RNA 聚合酶合成 RNA 的速度高于大肠杆菌 5 倍；2）T7 噬菌体 RNA 聚合酶只识别自己的启动子序列，不启动大肠杆菌 DNA 任何序列的转录
5、；3）T7 噬菌体 RNA 聚合酶对抑制大肠杆菌 RNA 聚合酶的抗生素有抗性；4）T7 噬菌体 RNA 聚合酶/启动子系统在一定条件下，基因表达产物可占细胞总蛋白的 25以上。载体：pET 表达系统 pET15，pET16，pET28，pET30，pET42 等 a/b/c三套，及 pRSET. pET28a 主要构件：T7 噬菌体启动子，乳糖操纵子，核糖体结合位点，His 标签序列，凝血酶切割位点，多克隆位点，T7 噬菌体终止子及乳糖阻遏子序列 lacI，pBR322 复制子，fl 噬菌体复制子，卡那霉素筛选标记序列等。大肠杆菌菌株：BL21(DE3)和 BL21(DE3)pLysS。(D
6、E3)菌株基因组上以溶原形式携带一个克隆的 T7RNA 聚合酶基因，IPTG（异丙基硫代D半乳糖苷）可诱导 T7RNA 聚合酶大量合成。二、 蛋白质的融合表达融合表达一般是将克隆化的基因引入某表达载体编码的高表达蛋白一起融合表达。高表达蛋白可以是担体蛋白，或任意在大肠杆菌总高效表达的基因具有良好的表达所需信号，融合蛋白的 N 端往往是担体序列编码的片段。融合蛋白表达策略：将融和蛋白以不溶性的聚集物形式表达，采用缺失抑制蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，试用不同的野生型菌株。以融合形式表达目的蛋白的优缺点：1）目的蛋白稳定性高 尤其对分子量较小的多肽效果更佳2）目的蛋白易于分离 利用受体蛋白成熟的抗
7、体、配体、底物进行亲和层析，可以快速获得纯度较高的融合蛋白3）目的蛋白表达率高 与受体蛋白共用一套完善的表达元件4）目的蛋白溶解性好 由于受体蛋白的存在，融合蛋白往往能在胞内形成良好的空间构象，且大多具有水溶性5）目的蛋白需要回收 融合蛋白需要裂解和进一步分离，才能获目的蛋白。在实际生产中，产品主要的成本往往就在该工段融合蛋白表达质粒的构建原则：1）受体细胞的结构基因能高效表达，且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化2）外源基因应装在受体蛋白编码基因的下游，为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下，并不需要完整的受体结构基因，目的是尽可能避免融合蛋白分子中两种组份的分子量过于接近，为目的
8、蛋白分离回收创造条件3）两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要，它直接决定着融合蛋白的裂解工艺4）两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架用于融合蛋白构建的受体蛋白：1）谷胱甘肽转移酶（GST） 维持良好空间构象2）麦芽糖结合蛋白（MBP） 促进分泌3）金黄色葡萄球菌蛋白 A（SAPA） 免疫亲和层析 pRIT2T4）硫氧化还原蛋白（TrxA） 维持良好空间构象 pTrxFus5）外膜蛋白（OmpF） 促进分泌6）b-半乳糖苷酶（LacZ） 免疫亲和层析7）泛素蛋白（Ubi） 维持良好空间构象GST 融和蛋白的表达与纯化：谷胱甘肽 S转移酶（GST）融合蛋白表达系统的载体是 pGEX 载体，
9、受体为普通大肠杆菌感受态细胞。载体含有 GST 完整的开放阅读框，多克隆位点，lacI 基因。经 IPTG诱导，脱阻遏，GST 融和蛋白表达。GST 担体最终由位点特异蛋白酶（PrescissionTM protease 酶）水解除去的。三、 蛋白质的分泌型表达是指周质蛋白、细胞内膜与外膜蛋白等以带有 N 端信号肽的前体形式首先在细胞质中合成，随后穿膜运送到周质或定位到内、外膜上的分泌过程。穿膜过程中，信号肽被信号肽酶切除。将目的蛋白的基因置于原核蛋白信号肽的序列的下游可能实现分泌型表达。分泌表达的优点：信号肽被切除后的蛋白质 N 末端的氨基酸序列与天然蛋白是一致的，周质空间中的蛋白酶活性比细
10、胞质中的要低，从而使蛋白质较稳定地存在于周质中，周质中只有少量的细菌蛋白，使分离纯化更容易，周质空间存在一个氧化的环境，使得二硫键更容易形成。分泌表达形式的缺点：相对其它生物细胞而言，大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达，少数外源基因既便能分泌表达，但其表达率通常要比包涵体方式低很多，因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽管有，但并不普遍四、 蛋白质的包含体形式表达与蛋白质复性重组蛋白在大肠杆菌中表达时，由于表达量高，绝大多数是以包含体形式存在的。即这些蛋白质在细胞内聚集成没有生物活性的直径0.13.0m 的固体颗粒。在某些生长条件下，大肠杆
11、菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB） 。富含蛋白质的包涵体多见于生长在含有氨基酸类似物培养基的大肠杆菌细胞中，由这些氨基酸类似物所合成的蛋白质往往会丧失其理化特性和生物功能，从而集聚形成包涵体。由高效表达质粒构建的大肠杆菌工程菌大量合成非天然性的同源或异源蛋白质，后者在一般情况下也以包涵体的形式存在于细菌细胞内。以包涵体形式表达目的蛋白的优点：能简化外源基因表达产物的分离操作。包涵体的水难溶性及其密度远大于其它细胞碎片和细胞成分，菌体经超声波裂解后，直接通过高速离心即可将重组异
12、源蛋白从细菌裂解物中分离出来。能在一定程度上保持表达产物的结构稳定。在形成包涵体之后，大肠杆菌的蛋白酶降解作用基本上对异源重组蛋白的稳定性已构不成威胁。以包涵体形式表达目的蛋白的缺点：以包涵体形式表达的重组蛋白丧失了原有的生物活性，必须通过有效的变性复性操作，才能回收得到具有正确空间构象（因而具有生物活性）的目标蛋白，因此包涵体变复性操作的效率对目标产物的收率至关重要。然而，这也是一个技术难题，尤其当目标蛋白分子中的 Cys 残基数目较高时，体外复性蛋白质的成功率相当低，一般不超过 30%包涵体的溶解与变性：包涵体的溶解与变性的主要任务是拆开错配的二硫键和次级键在人工条件下，使包涵体溶解并重新
13、进入复性途径中。能有效促进包涵体溶解变性的试剂和条件包括：清洗剂 SDS、正十二醇肌氨酸，廉价，但影响复性和纯化促溶剂 盐酸胍、尿素，前者昂贵，尿素便宜，但常被自发混合溶剂 如尿素与醋酸、二甲基砜等联合使用，溶解力增强极端 pH 廉价，但许多蛋白质在极端 pH 条件下发生修饰反应涵体的复性与重折叠的主要任务是：将多肽链中被拆开的游离巯基重新折叠通过次级键的形成使蛋白质复性五、 重组大肠杆菌的高密度培养重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效方法。大肠杆菌最高产率理论值可达 400g/L,实际可能达到的细菌密度仍可为 200g/L。启动子选择：噬菌体 PL 启动子温敏突变型，trp/t
14、ac 杂合启动子tac，T7RNA 聚合酶/启动子系统等，后两者均需 IPTG 诱导。培养基选择：培养方式选择：PH 值、温度等的选择第三节 基因在酵母中的高效表达（1.5）一、 酵母表达系统概述克服大肠杆菌表达系统的不足，能繁殖快，高密度发酵，可以进行蛋白质翻译后的修饰合加工。缺点：缺乏强有力的启动子，分泌效率差，表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失等。二、甲醇酵母表达系统利用甲醇作为唯一碳源。乙醇氧化酶将甲醇氧化为甲醛，乙醇氧化酶的启动子是强启动子，编码乙醇氧化酶的基因是 AOX1 合AOX2.AOX1 基因的表达受甲醇严格调控，诱导表达水平可达 30以上。野生型 Mut+， 突变型 Mut
15、s（AOX1 基因缺失）诱导机制：培养基以葡萄糖或甘油为碳源，抑制转录；培养基以甲醇为唯一碳源时，诱导基因转录、蛋白表达。受体菌：GS115，KM71, SMD1168 等载体： 无特定载体，整合型质粒。顺序：5AOX1，含有 AOX1 基因的强启动子，可调控异源蛋白的表达。同时也是载体和受体菌染色体发生重组整合的位点；接着 MCS,多克隆位点。接着 TT，是转录终止和多聚腺苷酸化序列；3AOX1，TT 序列下游区域。同源重组位点之一；His4，编码组氨酸，提供转化子的筛选标记，也是重组位点之一；ampr，氨苄抗性基因，允许在大肠杆菌中筛选。甲醇酵母的转化与目的基因的整合表达载体不含有酵母的复
16、制原点，导入酵母体内的重组载体必须先和酵母染色体的同同源区段发生重组，整合到染色体上，目的基因才能稳定存在，目的蛋白才能稳定表达。三、 组织纤溶酶原激活剂（t-PA, tissue-type plasminogen activator）在甲醇酵母中的表达正常的纤溶功能对于清除血管内不溶性纤维蛋白，保证血液循环畅通起重要作用。t-PA 与纤维蛋白亲和力很高，当 t-PA 接触到血栓后，立刻形成纤维蛋白、t-PA 及纤溶酶原三元复合体。 t-PA 选择性地高效激活血栓中的纤溶酶原生成纤溶酶，后者水解纤维蛋白，从而溶解血栓。t-PA 是糖蛋白，含 527 个氨基酸。单链。t-PA 基因的克隆与转化酵母细胞n GENEBANK 搜索全长 t-PAmRNA 序列n 逆转录获得 t-PA 的 cDNA 序列n PCR 扩增 t-PA 双链 cDNA 序列n 构建 pUC19 重组质
