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1、广州医学院硕士学位论文新型诱导剂钙离子载体联合GM-CSF体外诱导人外周血单核细胞 生成树突状细胞的研究姓名：彭卫斌申请学位级别：硕士专业：消化内科学指导教师：沙卫红;聂玉强20100501广州医学院硕士学位论文 2新型诱导剂钙离子载体联合GM-CSF体外诱导人外周血 单核细胞生成树突状细胞的研究 新型诱导剂钙离子载体联合GM-CSF体外诱导人外周血 单核细胞生成树突状细胞的研究 硕士研究生：彭卫斌 导 师：沙卫红 教授 聂玉强 教授 中文摘要中文摘要 目的目的： 1. 用组合细胞因子诱导人外周血单核细胞 （human peripheral blood mononuclear cell，PBM
2、C）生成树突状细胞（Dendritic cell，DC） 。 2. 用新型诱导剂钙离子载体 （Calcium Ionophore， CI） A23187 联合重组人粒细胞- 巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）体外诱导人外周血单核细胞生成 DC。 3. 观察 DC 刺激细胞毒性 T 淋巴细胞（CTL）对 K562 细胞（慢性髓性白血病细胞）产生的特异性杀伤作用。 方法：方法： 试验一： 1. 采用密度梯度离心法及黏附法分离出 PBMC，加入 rhGM-CSF+重组人白介素- 4（rhIL-4）诱导，第 5 天加入重组人肿瘤坏死因子-（rhTNF-） ，继续培养 2 天，刺激 DC 成熟。
3、2. 倒置显微镜观察细胞形态、数量的变化。 3. 流式细胞仪检测 DC 的表面标志。 4. 通过四甲基偶氮唑盐比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）检测 DC 刺激同种异体外周血 T 淋巴细胞增殖的能力。 新型诱导剂钙离子载体联合 GM-CSF 体外诱导人外周血单核细胞生成树突状细胞的研究 3试验二： 1. 采用密度梯度离心法及黏附法分离出 PBMC，分组培养： A： 传统方法组， rhGM- CSF+ rhIL- 4， 诱导 72h 后， 加入 rhTNF-， 继续培养 24h； B：新型诱导剂组，加入 rhGM- CSF+A23187，诱导 96h。 2
4、. K562 细胞抗原的制备：收集对数生长期 K562 细胞，反复冻融（-80/37） ，低温离心，取上清用微孔滤膜过滤，-20 保存备用。 3. 培养开始时分别予 K562 细胞冻融抗原致敏， 培养 96 小时后分别收集负载抗原的DC。 4. 倒置显微镜观察细胞形态、数量的变化。 5. 流式细胞仪检测 DC 的表面标志。 6. 将负载 K562 细胞抗原的 DC 刺激 T 淋巴细胞， 通过 MTT 比色法检测各组 DC 刺激同种异体外周血 T 淋巴细胞增殖的能力。 7. 通过 MTT 比色法检测各组 DC 对 K562 细胞的抑制作用。 8. 通过 MTT 比色法检测各组 DC 激活的 CT
5、L 对 K562 细胞的杀伤作用。 结果：结果： 试验一： 1. PBMC 经 rhGM-CSF 及 rhIL-4 诱导培养 5 天后， 多数细胞呈集落生长， 加入 rhTNF-继续培养 2 天后，可见细胞有典型的树枝状突起并呈散在分布。 2. 培养第 5 天时， DC 细胞表型 CD83、 CD1a、 CD86、 CD40 及 CD14 分别是 （14.32.2）%，（12.82.1）%， （20.11.8）%， （19.93.8）%及（16.23.3）%。加入 TNF-诱导后，即培养第 7 天，细胞表型 CD83、CD1a、CD86、CD40 及 CD14 分别是（29.84.4）%， （
6、18.24.5）%， （33.64.2）%， （28.14.3）%及（8.02.8）%（与第 5 天比较，P 值均0.05，其它效靶比均明显强，P0.05） ，且作用效应随效靶比的增加而增强，P0.05。 （见表 3） 。 3.5 负载 K562 冻融抗原的 DC 对肿瘤细胞的抑制作用 两组负载 K562 冻融抗原的 DC 对 K562 细胞均有抑制作用， 但新型诱导剂组 DC对K562细胞的抑制率较传统方法组DC明显强， 且随着效靶比的升高而增强， P0.05。（见表 4） 3.6 DC 刺激的 CTL 对 K562 细胞的杀伤作用 新型诱导剂组及传统方法组诱导的 DC 激活的 CTL 对
7、K562 细胞的杀伤性较单独 CTL 对 K562 细胞的杀伤性明显强，P 0.05。说明经体外诱导的 DC 负载肿瘤抗原后，各组均可诱导肿瘤特异性 T 细胞的产生，并杀伤肿瘤细胞。 新型诱导剂组诱导的 DC 激活 CTL 细胞对 K562 细胞的杀伤作用较传统方法组的明显强，P 0.05，且随着效靶比的升高而增强。 （见表 5） 4. 讨论 讨论 4.1 DC 疫苗免疫治疗的理论基础 广州医学院硕士学位论文 20通过体外分离或培养，可以获得足量的患者自身的 DC，负载肿瘤抗原后制备成肿瘤疫苗，回输患者后在体内有效提呈肿瘤抗原，打破肿瘤免疫逃逸的屏障，诱导肿瘤特异性 CTL 大量扩增与激活，在
8、一定程度上修复免疫网络的漏洞，清除肿瘤细胞。目前手术、放疗、化疗面临的最大困境是很难彻底清除残留的肿瘤细胞，尤其是难以杀灭静止期肿瘤细胞或肿瘤干细胞，导致肿瘤复发和耐药。而免疫系统特别适合于清除那些少量的残留肿瘤细胞。 所以人们期望肿瘤生物治疗尤其是免疫治疗能成为继肿瘤手术、化疗和放疗之后的另一种治疗手段，以延长肿瘤患者的无瘤生存期。近年来以树突状细胞为基础诱导特异性抗肿瘤免疫反应成为肿瘤生物治疗领域新的研究热点。 DC 抗肿瘤的机制：DC 摄取肿瘤抗原经加工处理后，提呈给 CD4+T 细胞，使之活化并发挥抗瘤效应；或提呈给 CD8+T 细胞产生特异性的细胞毒性 T 淋巴细胞，发挥抗肿瘤效应；
9、 DC 能产生一种具有抗原提呈能力的小体， 可诱导 T 细胞免疫应答，发挥抗肿瘤作用； DC 可通过合成和分泌一些细胞因子， 发挥抗肿瘤作用， 如 IL-12。IL-12 诱导 T 细胞、NK 细胞产生大量的 TNF、穿孔素和颗粒酶，从而使肿瘤细胞溶解。 DC 与肿瘤逃逸：肿瘤的免疫逃逸机制相当复杂，目前尚未完全清楚。首先是肿瘤方面的因素，由于肿瘤细胞的免疫原性低。另外不成熟 DC 只表达 MHC 抗原提呈分子，而缺少或低表达 CD80 、CD86 等共刺激分子。这些 DC 可诱导抗原特异性调节性 T 细胞(regulatory T cell，T reg) 及无反应性 T 细胞(anergic
10、 T cell) ，从而引起免疫耐受，期间 IL-10 是诱导 DC 介导免疫耐受的重要细胞因子17。在癌症病人，发现肿瘤组织的 DC 经常处于一种不成熟的状态，不能迁移到淋巴结。其次肿瘤细胞还分泌多种免疫抑制因子， 如转化生长因子、 白细胞介素 10 和表达某些蛋白分子，抑制调节性细胞因子分泌等，下调免疫效应细胞的活性，保护肿瘤细胞免受细胞毒性 T 细胞（cytotoxic T cell，CTL) 杀伤。再者肿瘤患者的 DC 的数量减少和功能低下或缺陷，因而不能有效提呈抗原和提供协同刺激信号，以致 T 细胞介导的抗肿瘤免疫未能有效发挥作用。Vermi 等18研究发现黑色素瘤组织内的 DC 数
11、量不仅较正常组织减少，而且其也存在着功能低下或缺陷，不能有效地激活 T 细胞，这可能是肿瘤逃避免疫监视的原因； Yanagimoto 等19发现胰腺癌患者循环血中 DC 数量也较正常对照组减少而且存在明显的功能缺陷。 新型诱导剂钙离子载体联合 GM-CSF 体外诱导人外周血单核细胞生成树突状细胞的研究 21DC 在抗肿瘤中的应用：目前研究的重点集中在对 DC 的“包装处理”上，要使DC 更好地发挥作用，对 DC 进行修饰是必要的，也就是 DC 瘤苗的制备，有些研究已经进入临床实验阶段，简单综述如下：肿瘤抗原多肽致敏 DC，此类抗原制备的瘤苗具有良好的靶向性，可有效激活细胞毒 T 淋巴细胞20-
12、21。肿瘤细胞融合 DC，Marten 等22用肾癌细胞融合 DC 治疗转移性肾癌有效，但其临床安全性及有效性还有待于进一步研究；肿瘤抗原替代物致敏 DC：肿瘤 RNA、mRNA 都可以传递肿瘤抗原信息，使 DC 致敏23。Peng 等24使用此瘤苗有效地诱导出特异性细胞毒 T 细胞， 杀伤肿瘤细胞。 基因修饰 DC ： 以 DC 为基础的基因治疗是利用基因重组技术，将肿瘤抗原基因或细胞因子基因等导入 DC，然后回输体内，通过基因的表达，可增强 DC 诱导的抗肿瘤作用。研究者们用 IL-2、IL-12 、IL-18 等基因修饰 DC ，试图使这种 DC 瘤苗在保持 DC 本身抗原提呈功能的同时
13、又持续性高分泌 IL-2、IL-12 、IL-18 等因子，起到协同抗肿瘤作用25。 4.2 CI 诱导人外周血单核细胞生成 DC A23187 作为一种 CI，能与钙离子形成稳定的复合物，充当流动的 Ca2 + 载体，使胞外 Ca2 +透过细胞膜，从而提高胞浆游离 Ca2 +水平，模拟某些细胞内信号转导事件，导致多基因活化26-27。Czerniecki 等28-29证实，单核细胞经 CI 处理 4 小时，CD83分子就开始表达，于 20 小时达高峰，48 小时开始下降，CI 处理后不再表达 CD14。目前认为，CI 能够增加细胞内钙离子的浓度，导致 Ca2+结合其调节蛋白-钙调蛋白（cal
14、modulin，CaM） ，使 CaM 的构象发生改变，进一步影响钙调蛋白依赖的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（calmodulin-dependent serine-threonine protein kinases，CaMK）的活性。应用 CaMK 的抑制剂 K252a、KT5926 能够显著影响 CD80、CD86、CD83 等分子的表达。钙离子增加还能使体内依赖钙调蛋白的磷酸酯酶（calcineurin，CaN）的活性增加，促进 NF-AT 向细胞核内移动，影响 IL-2 的转录，进而影响 T 细胞的增殖活化。临床上环孢菌素 A 既是与环孢亲和素（cyclophilin）结合形成复合物后与钙调
15、磷酸酶结合，抑制该酶的活性，使活化的 T 细胞核因子(NF-AT)不能向细胞核内移动，而阻断 IL-2 的转录作用。可见，钙离子载体诱导 DC 不仅影响 CD 分子的表达，也影响 T 细胞的增殖与活化， 这也能够解释为什么钙离子载体诱导 DC 后较细胞因子组能够获得更强的刺激 T 细胞增殖的能力。本实验运用新型诱导剂 CI A23187+rhGM-CSF组合与传统细胞因子 rhGM-CSF+rhIL-4+rhTNF- 组合分别诱导 PBMC 生成 DC，结广州医学院硕士学位论文 22果表明两种培养方案均能诱导出成熟的 DC， 但新型诱导剂 CI 组诱导出的 DC 具有更典型的树突状细胞的形态，
16、且有更强的 DC 的表面分子 CD83、CD1a、CD86、CD40表达，体外同种异体混合淋巴细胞反应示，CI 组刺激同种异体 T 淋巴细胞增殖较TNF- 组明显强，且随着效靶比的升高而增强。另外，CD1a 的表达较文献报告偏低，不除外 rhGM-CSF 对其中的影响，具体机制有待进一步研究。 理想的 DC 的诱导方法应具有方法简单、诱导周期短、诱导的 DC 作用效应强、价格低廉等特点。本研究提示新型诱导剂 CI A23187 联合 rhGM-CSF 诱导 PBMC 分化为 DC 的方法具备上述特点，较传统方法更经济实惠、快速高效。具体如下：CI诱导单核细胞分化为 DC 只需 2-3 天， 大大缩短了实验研究及临床治疗的周期； CI组整个诱导 DC 的过程只需要一种细胞因子 rhGM-CSF， 而 CI 较容易获得、 价格低廉，且不需要更换培养液及补充细胞因子，大大减少了实验及临床研究的费用；CI 组诱导出的 DC 表面分子 CD83、CD1a、CD86 及
