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1、实验三实验三 消毒与灭菌消毒与灭菌一、实验目的：一、实验目的：掌握微生物消毒与灭菌的方法二、实验原理二、实验原理灭菌是用物理或化学的方法来杀死或除去物品上或环境中的所有微生物。消毒是用物理或化学的方法杀死物体上绝大部分微生物(主要是病原微生物和有害微生物)。消毒实际上是部分灭菌。灭菌原理：高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。适用于一般培养
2、基、玻璃器皿、无菌水、金属用具。一般培养基在 1213灭菌 20 分钟即可。干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160170） ，时间长（12 小时） 。但干热灭菌温度不能超过 180，否则，包器皿的纸或棉塞就会烤焦，甚至引起燃烧，因而一般塑料制品不能用干热灭菌。三、实验仪器三、实验仪器高压蒸汽灭菌锅、电热烘箱、四、实验内容四、实验内容消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品
3、等方法。（一）加热法加热法又分干热灭菌和湿热灭菌两类。1.干热灭菌有火焰烧灼灭菌和热空气灭菌两种。火焰烧灼灭菌适用于接种环、接种针和金属用具如镊子等，无菌操作时的试管口和瓶口也在火焰上作短暂烧灼灭菌。通常所说的干热灭菌是在电烘箱内灭菌，此法适用于玻璃器皿如吸管和培养皿等的灭菌，在热空气 160-170下保温 2 小时进行灭菌。2.湿热灭菌（1）高压蒸汽灭菌法 此法是将物品放在高压蒸汽灭菌锅内 1.05kgcm2(15 磅/英寸2)，121.3保持 15-30 分钟进行灭菌。时间的长短可根据灭菌物品种类和数量的不同而有所变化、以达到彻底灭菌为准。这种灭菌适用于培养基、工作服、橡皮物品等的灭菌。（
4、2）间歇灭菌法 有少数培养基例如明胶培养基、牛乳培养基、含糖培养基等用干热灭菌和高压蒸汽灭菌均会受到破坏，则必须用间歇灭菌法。此法是用阿诺氏流动蒸汽灭菌器进行灭菌。该器底层盛水，顶部插有温度计，加热后水蒸汽温度达到 100时，即循环流于器内，水蒸汽碰到器内物体时，又凝成水，流至底层贮水处，故不至干涸。灭菌时，将培养基放在器内，每天加热 10030 分钟、连续三天，第一天加热后，其中的营养体被杀死，将培养基取出放室温下 18-24 小时，使其中的芽孢发育成为营养体，第二日再加热 l0030 分钟，发育的营养体又被杀死，但可能仍留有芽孢，故再重复一次，使彻底灭菌。一般凡能用高压蒸汽灭菌的物品均不采
5、用此法灭菌。（3）煮沸消毒法 注射器和解剖器械等可用煮沸消毒法。一般微生物学实验室中煮沸消毒时间为10-15 分钟，人用注射器和手术器械在有条件的地方，一般均采用高压蒸汽灭菌法或干热灭菌法灭菌。（二）过滤灭菌许多材料例如血清与糖溶液应用一般加热消毒灭菌方法，均会被热破坏，因此，采用过滤除菌的方法。应用最广泛的过滤器有蔡氏(Seitz)过滤器和膜过滤器。蔡氏过滤器是用银或铝等金属做成的，分为上、下两节、过滤时，用螺旋把石棉板紧紧地夹在上、下两节滤器之间，然后将溶液置于滤器中抽滤。每次过滤必须用一张新滤板，蔡氏过滤器的结构如图。滤膜过滤器的结构与蔡氏过滤器相似，只是滤膜是一种多孔纤维素(乙酸纤维素
6、或硝酸纤维素)，孔径一般为 0.45m， 过滤时，液体和小分子物质通过，细菌被截留在滤膜上，但若要将病毒除掉，则需更小孔径的滤膜。（三）紫外线灭菌紫外线波长在 200-300nm，具有杀菌作用，其中以 265-266nm 杀菌力最强。无菌室或无菌接种箱空气可用紫外线灯照射灭菌。、化学药品灭菌化学药品消毒灭菌法是应用能杀死微生物的化学制剂进行消毒灭菌的方法。实验室桌面、用具以及洗手用的溶液均常用化学药品进行消毒灭菌。常用的有 2%煤酚皂溶液（来苏尔） 、0.25%新洁尔灭、1%升汞、3-5%的甲醛溶液、75%酒精溶液等，见表-1。表 1 常用化学杀菌剂应用范围和常用浓度表类 别实 例常用浓度应用
7、范围醇 类乙 醇50-70%皮肤及器械消毒乳 酸0.33-lmol/L空气消毒(喷雾或熏蒸) 酸 类 食 醋3-5m1/m3 熏蒸消毒空气，可预防流感病毒碱 类石灰水1-3%地面消毒石炭酸5%空气消毒(喷雾) 酚 类 来苏尔2-5%空气消毒、皮肤消毒醛 类福尔马林40%溶液 2-6ml/m3 接种室、接种箱或厂房熏蒸消毒升 汞0.1%植物组织(如根瘤)表面消毒 重金属离子 硝酸银0.1-1% 皮肤消毒高锰酸钾0.1-3% 皮肤、水果、茶杯消毒过氧化氢3%清洗伤口氯 气0.2-1ppm 饮用水清洁消毒氧化剂漂白粉l-5% 洗刷培养基、饮水及粪便消毒去污剂新洁尔灭水稀释 20 倍 皮肤，不能遇热的
8、器皿消毒染 料 结晶紫2-4% 外用紫药水，浅创伤口消毒金属螯合剂8-羟奎啉硫酸盐 0.1-0.2% 外用、清洗消毒五、实验室常用灭菌方法五、实验室常用灭菌方法（一）干热灭菌用干燥热空气（170）杀死微生物的方法称干热灭菌。玻璃器皿(如吸管、平板等)、金属用具等凡不适于用其他方法灭菌而又能耐高温的物品都可用此法灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品等不能用干热灭菌法。干热灭菌操作步骤：干热灭菌操作步骤：1.装箱 将准备灭菌的玻璃器具洗涤干净、晾干，用纸包裹好，放入灭菌的长铁盒(或铝盒)内，放入干热灭菌箱内，关好箱门。2.灭菌 接通电源，打开干热灭菌箱排气孔，等温度升至 80-100时关闭排气孔，继续
9、升温至 160-l 70计时，恒温 1-2h。3.灭菌结束后，断开电源，自然降温至 60，打开电烘箱门，取出物品放置备用。注意事项：注意事项：1.灭菌物品不能堆得太满、太紧，以免影响温度均匀上升。2.灭菌物品不能直接放在电烘箱底板上，以防止包纸供焦。3.灭菌温度恒定在 l 60-l 70为宜，温度过高，纸和棉花会被烤焦。4.降温时待温度自然降至 60以下再打开箱门取出物品，以免因温度过高而骤然降温导致玻璃器皿炸裂。（二）加压蒸汽灭菌法高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继
10、续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于 100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。实验室中常用的高压蒸汽灭菌锅有立式、卧式和手提式等几种。本实验介绍手提式高压蒸汽灭菌锅的使用方法。手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：手提式高压蒸汽灭菌锅的使用操作步骤：1.首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。2.放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免防碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞。3.加盖，并将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对
11、称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使漏气。4.用电炉或煤气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排除涡内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用 1.05kg/cm2，121.3，20 分钟灭菌。5.灭菌所需时间到后，切断电源或关闭煤气，让灭菌锅内温度自然下降，当压力表的压力降至 0 时，打开排气阀，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。如果压力未降到 0 时，打开排气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染。6.将取出的灭菌培养基放入 37温箱培养 24 小时，经检查若无杂菌生长，即可待用。六、思考题六、思考题1、 各种消毒灭菌方法的作用机制是什么？2、 怎样使用高压蒸汽灭菌器，应注意哪些问题？3、 干热灭菌应注意哪些问题？
