《人参皂甙Rb1与Rg1在培养肾小管细胞缺氧复氧性损伤中的作用及机制研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人参皂甙Rb1与Rg1在培养肾小管细胞缺氧复氧性损伤中的作用及机制研究（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、泸州医学院硕士学位论文人参皂甙Rb1与Rg1在培养肾小管细胞缺氧复氧性损伤中的作用 及机制研究姓名：宋瑞申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：冯志强20060501人参皂甙R b l 与R g l 在培养肾小管细胞缺氧复氧性损伤中的作用及机制研究摘要目的：建立大鼠近端埒小管上皮细胞( N o r m a lR a tP r o x i m a lT u b u l a rE p i t h e l i a lC e l l s ，N R K 5 2 E ) 缺氧复氧( h y p o x i a - r e o x y g e n a t i o n ，H R O ) 损伤体外细胞培养模型，
2、研究人参皂甙( G i n s e n o s i d e s ，G S ) 的2 种单体成分R b l和R g l 在培养肾小管上皮细胞H R O 损伤中的作用，并探讨其机制。方法：建立体外培养肾小管细胞H R O 损伤模型将培养的细胞放入厌氧培养箱中，先将培养箱抽真空，再持续通入氮气。分别于缺氧6 h 、1 2 h 和2 4 h时取出细胞放入5 C 0 2 培养箱中复氧培养2 4 h 。培养细胞实验参数的确定用M I T 法测定体外培养的大鼠肾小管上皮细胞的O D 值以判定其增殖活性。绘制肾小管细胞的生长曲线，确定细胞最适接种密度和实验处理时间。通过不同时间缺氧复氧和不同浓度( 2 靴g
3、1 1 1 l 、劬g m l 、1 毗g m l 、2 5 t g m l 、5 0 M g m l 、7 5 # g m 1 ) 的R b l 或和R g l 引起的肾小管上皮细胞增殖活性的改变及细胞形态学的改变，确定适宜缺氧复氧时间和最佳药物浓度。人参皂甙R b l 和R g l 在培养大鼠肾小管细胞H R O 损伤中的作用及机制的探讨实验分组对照组( c o n t r o lg r o u p ) ，培养液为含1 0 胎牛血清( f e t a lb o v i n es e r u m ，F B S ) 的D M E M ，5 C 0 2 培养箱中常规培养；缺氧复氧组( H R O
4、 组) ，培养液为含I O F B S 的D M E M ，厌氧培养箱中缺氧培养1 2 h ，然后于5 C 0 2 培养箱中复氧培养2 4 h ( 下同) ；人参皂甙R b l + 缺氧复氧组( R b l + H R O 组) ，培养液为含5 , u g m l ( 最佳药物浓度)R b l 和1 0 F B S 的D M E M ，进行H R O 培养；人参皂甙R g l + 缺氧复氧组( R g l + H R O 组) ，培养液为含靴g m l ( 最佳药物浓度) R g l 和1 0 F B S的D M E M ，进行H R O 培养；人参皂甙R b l + 人参皂甙R g l +
5、缺氧复氧组( R b l + R g l + H R O 组) ，培养液为含跏g m l ( 最佳药物浓度) ( R b l + R 9 1 )和1 0 F B S 的D M E M ，进行H R O 培养。以上各组肾小管细胞接种密度为l5 1 0 4 m l ，常规培养2 4 h 然后用无血清培养液同步化1 2 h ，然后依上述分组处理方法培养3 6 h ，最后用M T F 法检测。肾小管细胞活性( O D 值) 以判定各组细胞增殖状况；免疫细胞化学法检测细胞中增殖细胞核抗原( p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e
6、n ，P C N A ) 表达情况；分光光度计比色法检测培养液中丙二醛( m a l o n d i a l d e h y d e ，M D A ) ，乳酸脱氢酶( 1 a c t a t ed e h y d r o g e n a s e ，L D H ) 含量和细胞内超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d e d i s m u t a s e ，S O D ) 活性。结果：正常肾小管细胞生长增殖状况肾小管细胞最适接种密度为5 0 l o m l ，接种后培养4 8 h 7 2 h 时生长迅速，培养至7 2 h 时细胞增殖最为活跃，之后生长速度逐渐变慢。缺氧复氧对正常肾小
7、管细胞活性的影响随缺氧时问延长，复氧后O D 值越来越低。缺氧6 h 复氧2 4 h 组同对照组的O D 值比较差异无显著性( n 0 0 5 ，下同) ：缺氧1 2 h复氧2 4 h 组和缺氧2 4 h 复氧2 4 h 组分别同对照组比较O D 值均减小，差异均具有显著性( P 0 0 5 ) T h eO Dv a l u e o fh y p o x i af o r1 2h o u r so r2 4h o u r sf o l l o w e db yr e o x y g e n a t i o nf o r2 4h o u r sg r o u ps i g n i f i c
8、a n t l yd e c r e a s e d ( P 0 20 104 8 h7 2 h9 6 h1 2 0 h图2 。f 子，J 、锐：匀| f 胞! I iI 丈J 线T h eg r o w t hc u F v eo fr e n a lt u b u l a rc e l l s- 1 H m l_ 一2 5 ：_ ，m l 十5 万m l7 5 万m I* - 1 0 7 i m l2 缺氧复氧对肾小管细胞活性的影响分别缺氧0 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 后复氧2 4 hl I , J ，i f , J , 管细胞增弛活性的变化见图3 。随缺氧时问延K ，复氧
9、后O D 值越水越低。缺氧6 h 复氧2 4 h2 1 【( 0 4 3 7 _ 0 0 1 5 ) I 司列J 姒纠【( 缺年eO h 后复年C2 4 h ) I ，| 勺O D 值( 0 4 4 9 _ + 0 0 3 0 )比较养异无娃著一盹( F = J 2 6 9 9 1 ，P = O 7 8 4 0 0 5 ) ；缺氧1 2 h 复氧2 4 h 纰( ( ) 3 9 3 _ + 0 0 2 5 ) 干| | 缺C2 4 | 1 址1 e2 4 h ? | | f ( 1 1 9 l ) 0 2 2 ) 分，】UF 日列j ! 镀纠【E4 交1 【l，ghFMO D 值减小，差异均具
10、有鼹著性( P l _ 0 0 0 5 ，P 2 = 0 0 0 0 0 0 5 + P 0 0 56 P O 0 5( R b l + R 9 1 ) g r o u p 带P O 0 5C o m p a r e dw i t hH R Og r o u p ，椰( O 0 1 ；c o m p a r e dw i t hc o n t r o lg r o u p ，。P O 0 5O 70 6 80 5鼍0 4o0 3 = g0 20 10 OC O f l t r oH R OR b l + H R OR g l + H R OR b l + R g l + H R ol 纠7R
11、b l 或引lR g l 刘H R O 拈 伤。Y f 小1 下组f | J 地j 杵蛔 f 西似：的影q _与H R O 鲥I 比较，# P O 0 5F i g7F h ee f f e c t so fR b lo r a n dR g lo nt h cp r o l i f e r a t i o no ft u b u l a rc e l l si n j u r e db yH R OC o m p a r e dw i t hI I R Og r o u p ，社，) 0 0 55 免疫细胞化学染色结果P C N A 定位于细胞核，I I I I 性染色呈红色。R b l 或
12、和R g l 作用后，胞核着色较H R O 组明显加深( 图8 A 8 E ) 。H R O 组同对照组比较P C N A 阳性表达率降低，差异具有显著性( x2 = 3 9 2 1 0 ，P = 0 o o o ) 。R b l + H R O 组、R g l + H R O ! t ：幂I I R b l + R g I + H R O 纽分别同t l R O 组比较，P C N A 阳性表达率均升高，差异均具有显著性( x2 = 4 5 7 4 ，P = 0 0 3 2 ；x2 = 6 0 8 8 ，P = 0 0 1 4 ；x2 = 1 5 4 4 8 ，P = 0 o o o ) ，
13、其中以R b l + R 9 1 + H R 0 组表达最强。R b l + H R O 组矛I I R g l + H R O 组比较差异无显著性( x2 = O 1 1 1 ，P = O 7 3 9 ) ( 表3 ) 。表3R b l 或和R g l 对I I R O 性肾小管细胞中P C N A 阳性表达率的影响T a b l e3T h ee f f e c t so fR b lo r a n dR g lO Be x p r e s s i o ni n d e xo fP C N Ai nt u b u l a rc e l l si n j u r e db yH R O组别P
14、CNA阳性表达翠 n鱼! ! ! 巳! 竺! ! ! ! ! ! ! 苎! ! ! ! ! 壁! i 望堕! ! 旦! ! 里! 生垒! 丝!C o n t r o l64 8 OH R O61 8 5 撑R b l + H R O62 7 5 +R g l + H R O62 9 0 堡垒! 垦g ! 坚墨Q垒兰璺：壁：与H R O 组比较，P 0 0 5 ) 。H R O 组同对照组比较肾小管细胞内的S O D 活力明显降低，差异具有显著性( P = O 0 0 0 0 0 5 ) ( 表4 和图9 ) 。表4 培养液t | l 的M D A 含量神Iy 小管细胞内的S O D 活力的变化
15、( z s ，F M D A = 5 5 4 0 1 ，F S O D = 6 6 1 8 1 )T a b l e4T h ec h a n g e so ft h ec o n t e n to fM D Ai nc u l t u r em e d i u ma n dt h ea c t i v i t yo fS O Di nt u b u l a rc e l l s ( ；s ，F M D A - - - - 5 5 4 0 1 ，F s o n = 6 6 1 8 1 )组别超氧化物歧化酶丙二n # U Q ! ! ! E一一墨Q 璺( 堕婴P ! ! 尘丛旦垒鱼型壁! 尘!
16、! )C o n t r o l62 4 6 9 0 2 7 41 8 5 7 ( ) 1 0 IH R O60 8 1 6 0 1 1 5 t 2 7 7 1 0 1 6 3 + +R b l + H R O61 7 4 3 0 】3 5 + + 撑1 8 2 9 0 1 2 ( 辫R g l + H R O61 7 6 8 0 1 4 5 + + 撑1 7 7 14 - 0 0 7 8 #R b l + R 1 + H R O62 _ 1 6 4 0 1 8 2 。群1 7 1 4 0 1 7 5 #j 对j ! 匀1 比较，t P O 0 5C o m p a r e dw i t hH R
