叶绿素等的测定方法

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1、叶绿素等的测定方法叶绿素等的测定方法1 叶绿素含量测定：80的丙酮液的配制：4L 丙酮 + 1L 蒸馏水。称 0.5g 左右的叶片放在 50ml 的离心管（做三个重复） ，加入 25ml浓度为 80的丙酮液，放在黑暗处浸提大约 36 小时后取出，稀释4 倍后分别在波长 663nm、645nm、652nm 和 470nm 下测定光密度，以 80的丙酮液为空白。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P3536）也可用 95%乙醇溶液，在 665、649、470nm 处有最大吸收峰Ca=13.95D665-6.8649Cb=24.96D649-7.32D665Cx.c=(1000D470-

2、2.05Ca-114Cb)/2452 抗氧化酶活性的定：（2.5g 样）0.05mol/L 磷酸缓冲溶液 (PBS)（pH=7.8）溶液的配制：65.5506g Na2HPO412H2O + 2.65285g NaH2PO42H2O, 定容到 4L。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 ，P134） 。取低温保存的鲜样，称 2g 左右的叶片（或根）放在 50ml 的离心管，加入 20ml 浓度为 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液（pH=7.8） （最好是较冷的磷酸缓冲溶液，防止研磨时温度过高使酶失活） ，研磨（用磨碎机磨） ，8000r/min 的冷冻离心机下离心 20 分钟，上清液

3、为粗酶液。2.1 丙二醛（MDA）的测定：20三氯乙酸（TCA）溶液的配制：称 200g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到 1000ml。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124） ；0.5% 硫代巴比妥酸（TBA）溶液的配制：称 5g 硫代巴比妥酸（TBA）,用 20三氯乙酸（TCA）溶液溶解并定容到 1000ml。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P124） （先加少量的氢氧化钠 1mol/L 溶解） ；0.5ml 酶液（对照用 0.5ml 的 0.05mol/L pH=7.8 的磷酸缓冲液代替酶液） （做三个重复）+ 3mlTBA振荡沸水浴上反应30min冷却（至少

4、 30min）比色（OD600、OD532、OD450） 。（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导 ，P124）2.2 超氧化物歧化酶（SOD）的测定：NBT(400ml)混合反应液 br /392mlPBS(Ph=7.8),+0.0206g NBT+ 0.776g 甲硫酸铵+8ml 核黄素溶液+0.4ml EDTA-Na 溶液（100mlPBS 缓冲溶液中含 0.01204g 核黄素） 。（另配）100ml PBS 溶液加 EDTA-Na 3.7224gEDTA-Na测试时：取 3ml 反应液+0.05ml(根)或 0.02 ml(叶)粗酶液，于光照培养箱中 6-10 分钟，OD650

5、 下测定吸光度。2.3 过氧化物酶（POD）的测定：0.05mol/L 磷酸缓冲溶液(PBS)（pH=7.0）溶液的配制：10.9251g Na2HPO412H2O + 3.042975g NaH2PO42H2O,定容到 1000ml。0.3%H2O2 溶液的配制：吸 2.5ml 30%H2O2，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml。0.2%愈创木酚溶液的配制：称 0.5g 愈创木酚，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 250ml。2ml 0.3%H2O2 溶液 + 0.95ml 0.2%愈创木酚溶液 + 1ml 0.0

6、5mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS) + 0.02ml？（原来为 0.01）酶液（根加 0.05ml 酶液） （对照用 0.05mol/L 磷酸缓冲溶液代替酶液） （做三个重复） ，记录 470nm 处 OD 降低速度。将每分钟 OD 增加 0.01 定义为 1 个活力单位。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）比色时加酶液，混合后即刻计时。2.4 脯氨酸的测定标准曲线的制作：编号1234567标准脯氨酸的量（ml）00.10.20.40.60.81.0H2O（ml）1.00.90.80.60.40.20冰乙酸（ml）2222222显色液（ml）3333333脯

7、氨酸含量（l）012468100.5ml 酶液（对照用 0.5ml 80乙醇代替） （做三个重复） + 1ml冰乙酸 + 1.5ml 显色液混匀，沸水浴 15min，冷却后测OD520。2.5 可溶性蛋白的测定（参考赵志杰，史国安，董新纯编的植物生理学实验指导 ）牛血清白蛋白：配成 100g/ml 和 1000g/ml。90乙醇：90ml 乙醇 + 10ml 蒸馏水。？85（W/V）磷酸：170ml 磷酸 + 30ml 蒸馏水。考马斯亮蓝 G-250:称 0.2g 考马斯亮蓝 G-250 溶于 100ml 90乙醇中，加入 85（W/V）磷酸 200ml，用蒸馏水定容到 2L。常温下可保存一个

8、月。标准曲线的制作：配制 0100g/ml 血清白蛋白血液管号123456100g/ml 牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量（ml）00.020.040.060.080.10配制 01000g/ml 血清白蛋白血液管号789101112100g/ml 牛血清白蛋白(ml)00.20.40.60.81.0蒸馏水量(ml)1.00.80.60.40.20蛋白质含量（ml）00.20.40.60.81.00.1ml 酶液（做三个重复） + 5ml 考马斯亮蓝 G-250混匀，放置 2min 后在 595nm 下比色。2.6

9、过氧化氢酶（CAT）的测定：0.3%H2O2 溶液的配制：吸 5ml 30%H2O2，用 0.05mol/L pH=7.0 磷酸缓冲溶液(PBS)定容到 500ml。1 ml 0.3%H2O2 溶液 + 1.9ml H2O + 0.1 ml 酶液，测定 240nm 处OD 降低速度。将每分钟 OD 减少 0.01 定义为 1 个活力单位。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P121）2.7 抗坏血酸（ASA）的测定：（参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P125）5 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：25g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到500ml。10 三氯乙酸（TCA）溶液的配制：

10、25g 三氯乙酸，用蒸馏水定容到 250ml。150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液的配制：100ml。44 H3PO4 溶液的配制：250ml。4 2,2-二联吡啶溶液的配制：250ml。3 FeCl3 溶液的配制：100ml。首先标制作准曲线。粗酶液的提取：取低温保存的鲜样，称 0.5g 左右的叶片（或根）放在 50ml 的离心管，加入 15m 5三氯乙酸（TCA）溶液（最好是较冷的三氯乙酸（TCA）溶液，防止研磨时温度过高使酶失活） ，研磨（用磨碎机磨） ，15000r/min 的冷冻离心机下离心 10 分钟，上清液为粗酶液，用于抗坏血酸（ASA）含量的测定。 （参考陈建

11、勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126）测定：0.2ml 粗酶液 + 0.2ml 150mmol/L NaH2PO4（pH 7.4）溶液 + 0.2ml H2O，混匀（振荡） ，至少 30 秒后，再依次分别加入：0.4 ml 10三氯乙酸（TCA）溶液 + 0.4 ml 44 H3PO4 溶液 + 0.4 ml 4 2,2-二联吡啶溶液 + 0.2ml 3 FeCl3 溶液，混合后在37水浴中保温 60min，测定 OD525 处的值。 （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导P125126）2.8 谷胱甘肽的测定：4g 新鲜材料 + 2ml 0.3mol/L 醋酸汞 + 2ml

12、 30醋酸钠后研磨匀浆，转移到离心管中，以蒸馏水冲洗残渣，并以玻璃棒搅拌，净置10min，使之充分沉淀，离心后弃去上清液，沉淀以水（每次10ml）在摇动情况下冲洗 2 次。向沉淀中加入 10ml 1mol/L 盐酸以溶解其中的谷胱甘肽，以玻璃棒搅拌 5min 后加入 1ml 20的碘化钾溶液，混匀，离心。上清液转入供滴定用的 100ml 玻璃管中，沉淀在搅动情况下以 10ml 水冲洗。离心后溶液与第一次离心液合并。向得到的溶液中加入 0.5ml 淀粉液，用 1mmol/L KIO3 滴定，直至出现不消失的蓝色为止。1ml 1 mmol/L 的 KIO3 相当于 0.307mg 谷胱甘肽。 （参

13、考现代植物生理学实验指南 ，中国科学院上海植物生理研究所编） 。2.9 天冬酰胺合成酶（AS）的测定：2.10 天冬酰胺转氨酶（AspAT）的测定：3 硝酸还原酶(NR)的测定采用离体法：（1g 样） （参考陈建勋，王晓峰主编的植物生理学实验指导,P2729）亚硝酸钠标准溶液（1g/ml）：称 NaNO2 0.9857g ,定容到1000ml，再吸 5ml 定容到 1000ml。0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液：30.0905g Na2HPO412H2O + 2.4965g NaH2PO42H2O，加蒸馏水定容到 1000ml。3mol/L HCl：125ml 浓盐酸加蒸馏水定容

14、到 500ml。1 磺胺溶液：5.0g 磺胺溶于 500ml 3mol/L HCl 中。0.2 a-萘胺溶液：1.0g a-萘胺溶于 125ml 冰醋酸后用蒸馏水定容到 500ml，贮于棕色瓶中。0.1mol/L KNO3 溶液：5.055g KNO3 溶于 500mln 0.1 mol/L pH7.5的磷酸缓冲溶液。0.025mol/L pH8.7 的磷酸缓冲溶液：Na2HPO412H2O 8.8640g + NaH2PO42H2O 0.0570g，加蒸馏水定容到 1L。提取缓冲液：1.211g 半胱氨酸 + 0.372g EDTA，溶于 1L 0.025 mol/L pH8.7 的磷酸缓冲

15、溶液。2mg/ml NADH 溶液：0.5g NADH 溶于 250ml 0.1 mol/L pH7.5 的磷酸缓冲溶液（临用前配制） 。首先标制作准曲线 br /取 7 支洁净烘干的 15ml 刻度试管加试剂，即配成 02.0g 的系列标准亚硝态氮溶液。摇匀后在 30保温箱或恒温水浴中保温30min，然后在 540nm 波长下比色。以亚硝态氮（g）为横坐标（x） ，光密度值为纵坐标（y）绘标准曲线或建立回归方程。各试剂加入顺序管 号1234567亚硝酸钠标准液(ml)00.20.40.81.21.62.0蒸馏水(ml)2.01.81.61.20.80.401 磺胺溶液(ml)44444440

16、.2%-萘胺(ml)4444444每管含 NO2- (g)00.20.40.81.21.62.01g 材料+15ml 提取缓冲液后研磨匀浆，转移到离心管中于 4、4000r/min 下离心 15min,上清液即为粗酶提取液，用于硝酸还原酶(NR)的测定。0.4ml+1.2ml 0.1mol/L KNO3 溶液 + 0.4mlNADH 溶液后混匀（对照不加 NADH 溶液，而以 0.4ml 0.1mol/L pH 7.5 磷酸缓冲液代替） ，在 25水浴中保温 30min。保温结束后立即加入 1ml 磺胺溶液终止酶反应，再加 1ml 0.2 a-萘胺溶液，显色反应 15min 后于4000r/min 下离心 5min，取上清液在 540nm 下比色测定吸光度。根据回归方程计算。