大田基黄中槲皮素和黄总黄酮的提取工艺及含量测定

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1、大田基黄中槲皮素和黄总黄酮的提取工艺及含量测定【摘要】目的 : 优选大田基黄总黄酮的最佳提取工艺和建立以高效液相色谱法 测定大田基黄中槲皮素含量的方法。方法: 以总黄酮含量为考察指标, 采用正交 设计的方法研究提取大田基黄总黄酮的工艺条件。HPLC 法测定槲皮素含量，色 谱柱为 ZORBAX SB- C18(250mm4.6mm,5m);流动相 : 甲醇-0.20%冰醋酸水溶 液(42:58),流量:1.0mL/min; 检测波长 360nm;柱温:25 ; 进样量 :20 L。结果： 乙醇浓度 60%,温度 60, 料液比 1：30, 提取时间 1 小时, 提取 2 次, 大田基黄总 黄酮得

2、率可达 38.2%，在 HPLC 法测定槲皮素含量中当进样量在20L 时色谱峰 的峰面积呈良好的线性关系(r=0.984), 槲皮素平均加样回收率为103。结论 ： 采用此工艺提取效果较好且操作简单迅速而HPLC 法测定槲皮素含量操作简便、 快速, 有良好的精密度和准确性 , 可用于大田基黄中槲皮素的质量控制。【关键字】大田基黄；黄酮；提取工艺；高效液相色谱法；槲皮素The Extraction Technology for Total Flavonoids and Determination of quercetin by HPLC from Lysimachia fortunei Maxi

3、mAbstract Objective:To study an extraction Technology for Total Flavonoids and determination of quercetin by HPLC from Lysimachia fortunei Maxim. Methods: The extraction conditions of total flavones were studied through the content of total flavones extracted.HPLC determination of quartering content

4、, for the column ZORBAX SB-C18 (250mm 4.6mm, 5 m) ; Mobile phase: methanol -0.20% glacial acetic acid solution (42:58), flow: 1.0mL/min; detection wavelength 360nm; column temperature: 25 ; injection volume: 20L .Results: 60% ethanol concentration, temperature 60 , liquid than 1:30, extraction time

5、1 hour, 2 extract, Big yellow Hypericum japonicum total falconoid yield up to 38.2 percent. HPLC determination in quartering content when the sary rate was 103.Conclusion: This extraction process using effective and easy to o mple volume 20L in the peak time of peak area was a good linear relationsh

6、ip (r = 0.984), quartering average recoveperate quickly. The HPLC determination of quartering content is simple, fast, with good precision and accuracy can be used for Lysimachia fortunei Maximquartering in the quality control Key WordsLysimachia fortunei Maxim; Total Falconoid; extraction technolog

7、y; HPLC; Quartering 大田基黄， 本品始载植物名实图考 ，原名红丝毛根。 全株无毛。 根茎横走， 紫红色。全草含摁贝素，紫金牛醌，槲皮素-3- 鼠李糖基 (12)半乳糖甙，异鼠 李素-3- 刺槐二糖甙，毛里求斯排草素及两种新黄酮醇甙，即槲皮素-3-(2 ，6- 二吡喃鼠李糖基吡喃哺半乳糖甙)和异鼠李素 -3-(2 ， 6-二吡喃鼠李糖基吡喃半乳 糖甙，黄酮类化合物具有多方的较强的生理活性1, 有降低血脂、保肝、抗炎、 扩冠、抗菌等功效 , 其应用开发具有广阔的前景，而对大田基黄尚缺乏系统的研 究, 尤其对大田基黄中黄酮类化合物的提取工艺研究报道很少。文章以乙醇为溶 剂, 以大

8、田基黄为原料 , 通过正交试验考察了提取时间、提取温度、 提取次数、 提 取剂中乙醇含量 ( 体积分数 )以及被提物质量与提取液体积之比( 料液比 ) 等因素 的影响 , 确定了较佳的提取工艺条件, 并根据黄酮类化合物与在碱性条件下 显色的原理进行测定其含量2-4, 为大田基黄文采用单因素实验和正交实验对大 田基黄全草中总黄酮提取工艺进行探讨, 并通过 HPLC 法测定大田基黄中槲皮素， 以为大田基黄总黄酮的开发利用提供理论依据。1 材料与仪器1.1 药品与材料大田基黄粉末（购于桂林六合路草药市场， 粉碎机粉碎过纱布）； 氢氧化钠 （广 东汕头西陇化工厂， A.R. , 批号： 020324

9、2） ；芦丁对照品（南京替斯艾么中药 技术研究所，批号：TCM027-080118 ） ；槲皮素对照品（中国药品生物制品检定所， 批号：10081-9905） ；亚硝酸钠 （广东汕头西陇化工厂， A.R. , 批号：080411 1） ； 结晶氯化铝（成都科龙化工试剂厂，A.R. , 批号： 20050916） ；甲醇（广东汕头 西陇化工厂， A.R. , 批号： 081012 1） ；甲醇（山东蜀王实业有限公司蜀城化工 厂，色谱纯）乙醇（广东汕头西陇化工厂，A.R. , 批号： 080527 1） ；丙酮（广 东汕头西陇化工厂， A.R. , 批号：0609052） ； 冰醋酸（广东汕头光华

10、化工厂， A.R. , 批号：20020521） ；盐酸（广东廉江市爱廉化试剂有限公司） ；乙醚（广东汕头西 陇化工厂， A.R. , 批号： 051522）1.2 仪器电子恒温水浴锅（国华仪器，型号:HH-6） ；光栅分光光度计 722 型（上海精密 科学仪器有限公司）；电子分析天平（赛多利斯公司，型号：BP2218 ） ；循环水式 多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司, 型号： SHB- ） ；高效液相色谱仪（Waters 600） ，紫外分光光度计 （岛津 ,UV2401PC ）2 实验方法2.1 大田基黄总黄酮的含量测定2.1.1 标准溶液的制备和标准曲线的绘制 精确称取 20mg芦丁对

11、照品， 以 60% 乙醇溶液超声溶解并定容至100mL ，摇匀即 得浓度为 0.2mg/ml 芦丁标准液，取8 ml 芦丁标准液于 25ml 的容量瓶 , ，, 加入 0.50mol/l的亚硝酸钠溶液 1.0ml, 摇匀静置 5min，加入 0.30mol/l氯化铝溶液 1.00 ml，摇匀静置 5min，加入 1.00mol/l氢氧化钠溶液 5.0ml, 摇匀显色后，用3Al60 乙醇水溶液定容至刻度， 10min 后用 1 比色皿在波长 360nm600nm 区间扫描 , 确定最大吸收波长为504.6nm。 分别移取上述芦丁储备液0、1.00 、2.00 、4.00 、6.00 、8.00

12、 、10.00 ml 于 7 个 25 ml 的量瓶中 , 显色后用 60 乙醇水溶液定容至刻度后于波长504.6 nm 处比 色测定，试剂空白为参比液， 绘制标准曲线， 用最小二乘法进行线性回归分析得 标准回归方程： A=2.35348C-0.03712，回归系数 R2=0.9865。测定吸光度与芦丁 浓度有很好的线性关系。 2.1.2 大田基黄中总黄酮含量的测定 准确称取 0.5g 大田基黄粉末，用 60% 乙醇以料液比 1：30，在 60提取 2 次， 每次 1h，定容进行定量分析，然后测定提取物中黄酮化合物含量。 总黄酮含量的测定：以芦丁为标样，采用亚硝酸钠- 三氯化铝比色法 5，在可

13、 见光 504.6nm处测定其吸光值。提取率(%)=(黄酮类化合物质量 / 干物料质量 ) 100% 。2.2 HPLC 测定大田基黄中的槲皮素2.2.1 色谱条件 : 色谱柱为 ZORBAX SB- C18(250mm 4.6mm ，5m)；流动相：甲 醇-0.20%冰醋酸水溶液 (42:58) ， 流量：1.0mL/min； 检测波长 360nm ； 柱温：25； 进样量： 20L。在此色谱条件下，样品中的槲皮素色谱峰与邻近的色谱峰达到 基线分离，保留时间为17.56min。 2.2.2 溶液的制备 供试品溶液的制备： 准确称量 25g的大田基黄粉末用乙醚脱色后, 准确称量脱 色后的大田基

14、黄粉末4.0g ， 与 80mL甲醇和 20mL 的 25% 盐酸用索氏提取器提取2 小时， 提取得的溶液过滤后用甲醇定容到100mL溶液瓶后 0.45 L微孔滤膜滤过， 即得。 对照品溶液的制备：精密称槲皮素对照品5.0mg，置于 50mL量瓶中，加甲醇 溶解并定容，制成0.1mg/mL的储备液。分别量取储备液0.5 、1.0 、1.5 、2.0 、 2.5 ml 置于 10mL溶液瓶中，用甲醇定容 , 配制成质量浓度分别为0.005 、0.010、 0. 015 、0.020、0.025mg/mL的溶液。3 实验结果3.1 大田基黄总黄酮的含量测定结果与分析3.1.1 提取溶剂选择 黄酮苷

15、元易溶于甲醇、 乙醇、丙酮等有机溶剂， 难溶于水，而黄酮苷易溶于水， 难溶于有机溶剂， 因此可用水或不同浓度的有机溶剂来提取。分别称取大田基黄 粉末 0.5g ，在 60水浴下，用不同浓度的甲醇、乙醇、丙酮提取2 次，时间每 次 2 小时。发现乙醇得率最高，甲醇次之，丙酮最低。结果见图1图 1 不同溶剂提取实验结果 3.1.2 单因素实验 3,1.2.1乙醇浓度对提取效果的影响 准确称取 0.5 g大田基黄粉末 7 份于 100mL圆底烧瓶中， 分别加入不同浓度的 乙醇溶液 (20% 、30% 、40% 、50% 、60% 、70% 、80%)10mL ，于 60水浴中回流提取 2 小时，滤过

16、定容到50ml 容量瓶后测定总黄酮含量, 。见图 2 图 2 不同乙醇浓度对提取率的实验结果 可知，随着乙醇浓度的增加, 提取率亦随之增大，当乙醇浓度达到70% 时，黄酮 类化合物溶解度最大， 提取率最高而后， 乙醇浓度增加， 黄酮类化合物溶解度减 小，同时一些醇溶性杂质、色素、亲脂性强的成分溶出量增加。 3.1.2.2温度对提取效果的影响 准确称取 0.5 g大田基黄粉末 7 份于 100mL 圆底烧瓶中，加入 70% 的乙醇 10mL ， 分别在不同温度 (50、60、70、80)回流提取 2 小时，滤过定容到50 mL102030401020304050607080乙醇浓度 /%得率/%0510152025303540405060708090不同浓度 /%得率/%甲醇乙醇丙酮容量瓶后测定总黄酮含量。见图3 252627282930405060708090100温度 / 得率/%图 3 不同温度对黄酮得率的影响 由图 3 可以看出， 随着提取温度的升高， 总黄酮提