生物选修三(现代生物科技)

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1、生物选修三生物选修三( (现代生物科技现代生物科技) )生物选修三(现代生物科技).txt 你妈生你的时候是不是把人给扔了把胎盘养大？别把虾米不当海鲜。别把虾米不当海鲜。DNA 重组技术的基本工具培育抗虫棉的关键步骤：关键步骤一：抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来关键步骤二：形成重组 DNA关键步骤三：重组 DNA 导入受体(棉花)细胞一、 “分子手术刀” 限制性核酸内切酶（简称限制酶）1、来源：主要是从原核生物中分离纯化出来 2、种类：4000 种3、作用：识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。4、结果：形成两种末端：黏性

2、末端和平末端大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别 GAATTC 序列，并在 G 和 A 之间切开。 黏性末端被限制酶切开的 DNA 两条单链的切口，带有几个伸出的核苷酸，他们之间正好互补配对，这样的切口叫黏性末端。平末端当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的 DNA 两条单链的切口，是平整的，这样的切口叫平末端。要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？可产生几个黏性末端？要切两个切口，产生四个黏性末端。如果把两种来源不同的 DNA 用同一种限制酶来切割，会怎样呢？会产生相同的黏性末端，然后让两者的黏性末端黏合起来，就似乎可以合成重组的 DNA 分子了。二、基因的针线DN

3、A 连接酶DNA 连接酶连接形成磷酸二酯键DNA 连接酶和 DNA 聚合酶的比较比较 DNA 连接酶 DNA 聚合酶 不同点 连接 DNA 片段 （双链） 连接游离的脱氧核苷酸 （单链）不需要模板需要模板相同点连接不同脱氧核苷酸之间的磷酸和脱氧核糖导入过程需要运输工具运载体 运载体必须同时满足四个要求：能进入受体生物细胞并在受体生物细胞内复制并表达；具有多个限制酶切点，便于与目的基因结合；具有某些标记基因，便于筛选。 （如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应的基因等 ） 对受体细胞无害，易分离 运载体的作用：1、作为运载工具，将外源基因转移到受体细胞中去。2、利用运载体在受体细胞内，对外源基因进

4、行大量复制。常用的运载体：质粒、 噬菌体衍生物、动植物病毒等质粒质粒是基因工程最常用的运载体，它广泛地存在于细菌中，是细菌染色体外能够自主复制的很小的环状 DNA 分子，大小只有普通细菌拟核 DNA 的百分之一。质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的复制则只能在宿主细胞内完成。基因工程的基本操作程序基因的结构（原核细胞）RNA 聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。转录开始后，RNA 聚合酶沿 DNA 分子移动，并与 DNA 分子的一条链为模板合成 RNA。转录完毕后，RNA 链释放出来，紧接着 RNA 聚合酶也从

5、DNA 模板链上脱落下来。非编码区：不能转录为信使 RNA，不能编码蛋白质编码区：能够转录为相应的信使 RNA，进而指导蛋白质的合成，也就是说能够编码蛋白质真核细胞的基因结构外显子: 能够编码蛋白质的序列叫做外显子 内含子: 不能够编码蛋白质的序列叫做内含子，内含子能转录为信使 RNA 信使 RNA 前体 信使 RNA 真核细胞的基因在转录时内含子和外显子是一起转录的，因而转录产生的 mRNA 必须经过加工，将内含子转录部分剪切掉，将外显子部分拼接起来，才能成为有功能的成熟的 mRNA。原核生物的基因由于不含有外显子和内含子，因此，转录产生的 mRNA 不需要剪切、拼接等加工过程。 原核细胞与

6、真核细胞的基因结构比较原核细胞 真核细胞不同点编码区是连续的 编码区是间隔的、不连续的相同点都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的基因工程操作的基本步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。目的基因的制备?目的基因就是所需要克隆的外源基因 （主要指编码蛋白质的结构基因）?制备方法：1、人工合成法 2、逆转录法 3、用限制性内切酶直接从染色体 DNA 中离 4、用 PCR 法扩增目的基因片段 5、从基因文库中获取目的基因的制备：人工合成法?较小分子基因可用人工化学合成的方法获得?人工合成目的基因的先决条件是基因的核苷酸序列是已知的?

7、缺点是：1、不能合成太大的基因；2、合成基因时遗传密码的兼并现象会为选择密码带来很大困难；3、费用较高目的基因的制备：逆转录法?若所需基因较大，人工合成有困难，从组织中分离提取也不容易，则可利用逆转录法合成。?该法是：以编码某特异多肽的 mRNA 为模板，在逆转录酶的作用下反转录成该多肽 mRNA 的互补 DNA（cDNA） ；再以 cDNA 为模板，在DNA 聚合酶作用下，最终合成编码该多肽的双链 DNA。可用于真核生物目的基因的获得?用逆转录法合成 cDNA 的主要问题是：1、mRNA 必需提得很纯2、逆转录中常产生各种不完全的逆转录产物，3、以单链 cDNA 为模板往往难以合成与单链 c

8、DNA 一样长的dscDNA，这与实验技术有关。用限制酶切法直接从染色体 DNA 中分离?此方法主要适用于制备原核基因?对于物理图谱已清楚的原核基因，可用限制酶把目的基因切出来?鸟枪法是指把目的基因从已用限制酶降解的染色体片段群中分离纯化出的方法，即把包括目的基因在内的全部 DNA 片段插入到载体DNA 中，转化大肠杆菌，做成基因文库。再用目的基因的转录产物作探针，通过分子杂交，选择出含有所需基因的 DNA 片段。用 PCR 方法扩增目的基因片段?PCR 是聚合酶链反应的缩写?是一种在体外模拟天然 DNA 复制过程的核酸扩增技术?在有少量 DNA 模板、引物、四种脱氧核苷酸、TaqDNA 聚合

9、酶、合适的缓冲系统下，通过仪器控制 DNA 变性、退火及延伸的温度与时间，来合成新的 DNA 链，新合成的 DNA 链又可作为下一轮循环的模板。理论上经 n 次循环后，DNA 链可达 2n利用 PCR 技术扩增目的基因概念：PCR 全称聚合酶链式反应 ，是一项在生物体外复制特定 DNA片段的核酸合成技术 原理：DNA 复制条件：已知基因的核苷酸序列、四种脱氧核苷酸、引物、耐高温DNA 聚合酶方式：以指数 方式扩增，即 2n（n 为扩增循环的次数）结果：使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增过程：A、DNA 变性（90-96）：双链 DNA 模板在热作用下，氢键断裂，形成单链 DNAB、退火（

10、复性 55-60）：系统温度降低，引物与 DNA 模板结合，形成局部双链。 C、延伸（70-75）：在 DNA 聚合酶的作用下，从引物的 5端3端延伸，合成与模板互补的 DNA 链。 D、多次重复(一)从基因文库中获取目的基因2.基因文库的构建方法鸟枪法：(直接分离法)反转录法：以目的基因转录成的信使 RNA 为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链 DNA，从而获得所需的基因。根据已知的氨基酸序列合成 DNA 法 ：根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测出相应的信使 RNA 序列，然后按照碱基互补配对原则，推测出它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学方法，以单核苷酸为原料合成目的基

11、因优点缺点鸟枪法操作简便广泛使用工作量大，盲目，分离出来的有时并非一个基因 反转录法 专一性强 操作过程麻烦，mRNA 很不稳定，要求的技术条件较高根据已知氨基酸合成 DNA 法专一性最强仅限于合成核苷酸对较少的简单基因(二)基因表达载体的构建 核心1.用一定的限制酶 切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。2.用同一种限制酶 切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。3.将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量 DNA 连接酶，形成了一个重组DNA 分子（重组质粒） 4.过程: 5.基因表达载体的组成：目的基因+启动子+终止子+标记基因基因工程载体的构建需要考虑哪些方面的因素？（1）基

12、因的特点 （2）要选择强启动子或组织特异性启动子。启动子有强有弱，选择强启动子可以增加转录活性，使基因产物量增多。如果希望基因在生物的某个组织表达，如只在植物种子中表达，就要选择种子中特异表达的启动子。（3）要有选择标记基因，如抗生素基因，以便选择出真正的转基因生物 (三)将目的基因导入受体细胞1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍（2）原理及适用范围2、将目的基因导入动物细胞（1）方法：显微注射法 （2）程序： 3、将目的基因导入微生物细胞Ca2+处理受体细胞成为感受态细胞,再进行混合 (四)目的基因的检测与鉴定检查是否成功使大肠杆菌生产出鼠的 -珠蛋白的设计： （1

13、）从小鼠中克隆出 -珠蛋白基因的编码序列（cDNA） （2）将 cDNA 前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明 -珠蛋白基因已进入其中 （4）培养进入了 -珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取 -珠蛋白基因工程的应用（基因工程的应用是基因工程基本操作程序的一个必然结果）转基因生物 目的基因 目的基因从何来 抗虫棉 Bt 毒蛋白基因 苏云金芽孢杆菌 抗真菌

14、立枯丝核菌的烟草 几丁质酶基因和抗毒素合成基因 抗盐碱和干旱作物 调节细胞渗透压的基因 耐寒的番茄 抗冻蛋白基因 鱼 抗除草剂大豆 抗除草剂基因 增强甜味的水果 甜味基因 降低乳糖的奶牛 肠乳糖酶基因 生产胰岛素的工程菌 人胰岛素基因 人 二、植物基因工程硕果累累植物基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力，以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。1、抗虫转基因植物方法：从某些生物中分离出具有杀虫活性的基因，将其导入作物中，使其具有抗虫性目的基因包括：Bt 毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等?Bt 毒素对哺乳动物无毒害作用，被广泛地用来构建抗虫转基因作物。

15、?植物凝集素是一种糖蛋白或结合糖的蛋白质，存在于多种植物中，特别是富含于植物种子和储藏器官。抗病毒转基因植物?病毒外壳蛋白转基因植物?病毒复制酶转基因植物。3、抗逆转基因作物4、利用转基因改良植物的品质 方法：将必需氨基酸含量多的蛋白质编码基因，导入植物中，或者改变这些氨基酸合成途径中某种酶的活性。 三、动物基因工程前景广阔1、用于提高动物生长速度目的基因：生长激素基因2、用于改善畜产品的品质?就基因药物而言，最理想的表达场所是哪里？转基因动物的乳腺。?为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？1）乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。2）从乳汁中获

16、取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。3）从乳汁中源源不断获得目的基因的产 物 5、用转基因动物生产药物1、用动物乳腺作为反应器，生产高价值的蛋白质比工厂生产的优越之处有哪些？A、产量高；B、质量好；C、成本低；D、易提取 2、用基因工程技术实现动物乳腺生物反应器的操作过程是怎样的？6、用转基因动物作器官移植的供体 供体动物：猪存在的难题：免疫排斥解决方法：将供体基因组导入某种基因调节因子，以抑制抗原决定基因的表达，或设法除去抗原决定基因，再结合克隆技术，培育出没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官。7、基因工程药品异军突起 工程菌：用基因工程的方法，使外源基因得到高效率表达的菌类细胞株系。 我国已生产的产品：白细胞介素-2、干扰素、乙肝疫苗等利用微生物生产药物的优越性何在?所谓利用微生物生产蛋白质类药物，是指将人们需要的某种蛋白质的编码基因，构建成表达载体后导入微生物，然