Northern blot实验步骤

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1、一、一、经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的经乙二醛和二甲基亚砜变性处理后进行的 R R NANA 电泳电泳这一方法原于 McMaster 和 Carmichael（1977 ） 。含有乙二醛DMSO 的凝胶比含有甲醛的凝胶 更难于进行电泳，因为前者泳动速率较慢而且需 将电泳液时行循环以避免电泳过程中形成过高的 H+梯度。尽管上述两种凝胶具有近乎相等的分辨 率（Miller，1987） ，但用含有乙二醛DMSO 的 凝胶对 RNA 进行分级离，通常 Northern 杂交所 显示的 RNA 条带更为锐利。1、在灭菌的微理离心管内，混匀下列液体：6mol/L 乙二醛 5.4ulDMSO 16.0

2、ul0.1mol/L 磷酸（pH7.0） 3.0ulRNA（多达 10ul）5.4ul 市售乙二醛通常为 40%溶 液（6mol/L） 。由于接触空气的后乙二醛易于氧化 ，所以使用前需通过混合床树脂（Bio-Rad AG 5 01-X8 对乙三醛溶液进行去离子处理，直至溶液 pH 值大于 5.0 为止，然后可分装在小份，用盖紧 的小管贮存于20。每小份乙二醛溶液只用 1次，剩余液体应予丢弃。0.1mol/L 磷酸钠（pH7. 0）的配法如下：将 3.9ml 1mol/L 磷酸二氢钠、6. 1ml 1mol/L 磷酸氢二钠和 90ml 水混合，用 DEP C 处理上述溶液后高压灭菌。每一泳道至多

3、可分 析 10ug RNA，通常用 1020 ug 细胞总 RNA 进行 Northern 杂交，可以检测高丰度 mRNA（占 mRNA 总量的 0.1%以上） ，如等测 RNA 含量极微 ，每个泳道应加 0.53.0ug poly（A）+RNA。2、将微量离心管盖严，将 RNA 溶液置于 50 温育 60 分钟后，用冰水浴冷却样品，离心 5 秒钟 ，使管内所有液体沉降至管底。3、于 50温育 RNA 溶液的同时，灌制琼脂糖 水平凝胶，用 1.4 %琼脂糖分析 1kb 以下的 RNA 样品， 而用 1%琼脂糖分析 1kb 以上的 RNA 样 品。加入 0.1mmol/L 磷酸钠（pH7. 0

4、）后，升 温至 70 ， 加入碘乙酸钠固体至终浓度为 10m mol/L（使 RNA 酶失活） ，再降温至 50，制胶 ，加入 RNA 样品前一至少放置 30 分钟使其凝固 。用于 RNA 电泳的电泳槽需用去污剂溶液洗净， 用水冲洗，用乙醇干燥，然后灌满 3%H2O2，于 室温放置 10 分钟后，用经 DEPC 处理的水彻底冲 洗电泳槽。因乙二醛可与溴化乙锭发生化学反应，所以制胶和电泳过程中诮避免作用溴化乙锭。4、将 RNA 样品冷却至 0，加入 4ul 灭菌的 并经用 DEPC 处理的戊二醛-DMSO 凝胶中样缓冲 液，随后立即将上述样品加至凝胶加样孔。用已 知大小的乙醛酰 RNA 作为分子

5、量标准参照物，如 用 18S 和 28S rRNA 或 9S 兔珠蛋白 mRNA， 上述 RNA 长度分别为 6322、2366 和 710 个碱基 。也可以从 BRL 购置已知大小的 RNA 混合物作 为分子量标准照物。通常分子量标准参照物的泳 道位于凝胶边缘，便于电泳后将其切去进行溴化 乙锭染色，可能的话应在分子量标准参照物以及 欲转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜的样品之间留 空一个泳道。乙二醛-DMSO 凝胶加样缓冲液50%甘油10mmol/L 磷酸钠（pH7.0）0.25%溴酚蓝0.25%二甲苯青 FF5、将凝胶浸入 10mmol/L 磷酸钠电泳液中，以 3-4V/cm 电压降进行电泳，同

6、时按图 7.1 对磷酸钠容液时行持续再循环，使溶液 pH 值维持在可被接 受的限度 内（pH8.0 时乙二醛将从 PNA 分子上 解离） 。另一方法为电泳时每 30 分钟换一次磷酸 钠缓冲液。6、电泳结束后（溴酚蓝迁移出区 8cm） ，切下 分子量标准参照物的凝胶条，浸入溴化忆锭溶液 （0.5ug/ml，用 0.1mol/L 乙酸铵配制）中染色 30-45 分钟。 在凝胶放置一透明迟，在紫外灯下照片上每个 RN A 条带至加样孔的距离，以 RPN 片段大小的 lg 对 数值对 RNA 条带的迁移距离作图，用所得曲线计 算从凝胶移到固相支持体后通过杂交检出的 RNA 分子的大小。7、RNA 从凝

7、胶转移至硝酸纤维素滤膜，将 RN A 转移至尼龙膜。二、将变性二、将变性 RNA 转移至硝酸纤维素滤膜转移至硝酸纤维素滤膜电泳完毕后，可立即将乙醛酰 RNA 自琼脂糖凝 胶转移至硝酸纤维素滤膜，有以下几种转移方法 ：毛细管洗脱法、真空转移法和电印迹法。毛细 管洗脱法如下所述， 真空转移法和印迹法则按有关仪器生产厂家产品说明书进行。尽管有人认为 在转移前对琼脂糖凝胶进行预处理实属不必（Tho mas，1980）甚至有害（Thomas，1983） 。但我们认为含甲醛的凝胶必须用经 DEPC 处理 的水淋洗数次，除去甲醛。如果琼脂糖中浓度大 于 1%或凝胶厚度大于 0.5cm 或待分析的 RNA 大

8、 于 2.5kb，需用 0.05mol/L 氢氧化纳浸泡凝胶 20 分钟。 然后在凝胶上放置硝酸纤维素凝膜或尼龙 膜，RNA 随向上迁移的缓冲液转移至固相支持体 （硝酸纤维素滤膜或尼龙膜）上。1、将凝胶移至一个玻璃皿内，用锋利刀片修凝 胶的无用部分，在凝胶左上角（加样孔一端为上 ）切去一角，以作为下列操作过程中凝胶方位的 标记。2、用长和宽均大于凝胶的一块 Plexiglas 有机 玻璃或一叠玻璃板作为平台，将其放入大千烤皿 内，上面放一张 Whatman 3MM 滤纸，倒入 20x SSC 使液面略低于平台表面，当平上方的 3MM 滤纸温透后，用玻棒赶出所有的气泡。3、用一把新的解剖刀或切纸

9、刀裁一张硝酸纤维 素滤膜（Schleicher &Schuell BA85 或与之相当的产品） 。滤膜的长度和宽度应分别比凝胶大 1m m， 接触滤膜时须戴手套或用平头镊子（例如 Mil lipore 镊子） ，用有油腻的手接触过的硝酸纤维素 滤膜不易浸温。4、将硝酸纤维素滤膜浮在去离子水表面，直至 滤膜从下向上湿透为止，随后用 20xSSC 浸泡滤 膜至少 5 分钟，用干净的解剖刀片切去滤膜一角 ，使其与凝胶的切角相对应。不同批号的硝酸纤 维膜，其浸湿速率相差悬殊。如滤膜池浮在水面 上几分钟后仍未湿透，应另换一张新滤膜，因为 未均匀浸湿的滤膜进行 RNA 转移是靠不住的。这 种滤膜也不必丢弃

10、，可将其夹在用 2xSSC 浸湿的 3MM 滤纸中间，高压 5 分钟。通常上述处理足以 使硝酸纤维素滤膜湿透。高压处理的滤膜应夹在 经过高压理理并用 2xSSC 浸湿的 3MM 滤纸中间 ，装入塑料袋，密封后于 4保存备用。5、将凝胶翻转后置于平台上温润的 3MM 滤纸 中央，3MM 滤纸和凝胶这间不能滞留气泡。6、用 Saran 包装膜或 Parafilm 膜围绕凝胶周 边，但不是覆盖凝胶， 以此作为屏障，阻止液体 自液池直接流至凝胶上方的纸巾层中。并非堆放得十分整齐的纸巾，易于从凝胶的边缘垂下并与 平台接触，这种液流的短路是导致凝胶中的 RNA 的转移效率下降的主要原因。7、在凝胶上方放置

11、温润的硝酸纤维素滤膜，并 使两者的切角相重叠。滤膜的一条边缘应刚好超 过凝胶上部加样孔一线的边缘。滤膜置于凝胶表 面适当位置后，就不应轻易移动，滤膜与凝交之 间不应留有气泡。8、用 2xSSC 溶液浸湿两张与凝胶同样大小的 3MM 滤纸， 温润的放置在湿润的硝酸纤维滤膜 上方。用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。9、切一叠（5-8cm 高）略小于 3MM 滤纸的纸 巾，将其放置在 3MM 滤纸的上方。并在纸巾上方 放一块越境玻璃板，然后用-500g 的重物压实。其 目的是建立液体自液池经凝胶向硝酸纤维素滤膜 的上行流路，以洗脱凝胶中的 RNA 并使其聚集在 硝酸纤维素滤膜上。10、使上述 RNA 转移

12、持续进行 6-18 小时，每 当纸巾浸湿后，应换凝的纸巾。11、转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和 3MM滤纸，翻转凝胶和硝酸纤维素滤膜，以凝胶的一 面在上，置于一张干的 3MM 滤约纸上，用一支极 软铅笔或圆珠笔，在滤膜上标记凝胶加样孔的位 置。12、从硝酸纤维素滤膜上剥离凝胶弃之。以 6x SSC 溶液于室温浸泡滤膜 5 分钟，这一步可以除 去粘着在滤膜上的琼脂糖碎片。从 6xSSC 溶液中 取出滤膜，将滤膜上的溶液滴尽后平放在一张纸 巾上。于室温晾干 30 分钟以上。为估计 RNA 的 转移效率， 可将胶置于溴化乙锭溶液（0. 5 ug/ ml ， 以 0.1mol/L 乙酸铵配制）中染色

13、 45 分钟 ，于紫外灯下观察。13、将晾干的滤膜放在两经张 3MM 滤纸中间 ，用真空炉于 80干烤 0.5-2 小时。如干烤时间 过长，滤膜极易脆裂并可能发黄。如果滤膜并不 立即用于杂交实验，可用铝箔宽松地包裹起来， 在真空下贮存于室温。14、仅适用于滤膜上含有乙醛酰 PNA 的情况： 杂交前需用 20mmol/L Tris-Cl（pH8.0）于 65 洗膜，除去 RNA 上的乙二醛分子。三、转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的三、转移至硝酸纤维素滤膜前后进行的 RNA 染染色色当 RNA 自琼糖凝胶转移至硝酸纤维素滤膜之前 ，溴化乙锭的染色时间一般不宜过长，这是因为 被染料饱和的核酸分子，其转

14、移效率有所降低。 然而，用溴化乙锭作短暂染色，既不至于对核酸 转移过程产生可以察觉的掏作用，又独具同时检 测凝胶和凝膜上的 RNA 的优点。（一）方法 I1、电泳结束后，含乙二醛-DMSO 的凝胶应浸 入含溴化乙锭（0.5 ug/ml）的 10mmol/L 磷酸钠 （pH7.0）溶液。甲醛凝胶需用无 RNA 酶的水淋 洗，用 20xSSC 溶液浸泡，随后用含溴化乙锭（0.5 ug/ml）的 20xSSC 溶液染色。2、于室温染色 5-10 分钟，在紫外灯下观察， 照像。3、按前所述方法， 将凝胶中的 RNA 转移至硝 酸纤维素滤膜，转移后能常在学光下也可看出已 染色的 RNA 条带。这种方法仅

15、适用于每一泳道均含有相当大量（ 如 5ug 以上）的 RNA 的情况。（二）方法硝酸纤维素滤膜上的 RNA 也可以用下述方法染 色：从干烤后的硝酸纤维素滤膜上剪下所需的条 带进行染色，也可以用经过杂交并经 X 光片曝光 后的整张滤膜进行染色（A.Efstratiadis，未了表材 料） 。1）将干燥的滤膜浸入 5%冰乙酸中，于室温浸 泡 15 分钟。2）再将滤膜转移至 0.5mol/L 乙酸钠（pH5.2） 、0.04%亚甲蓝溶液中， 于室温浸泡 5-10 分钟。3）用水淋洗滤膜 5-10 分钟后，可见 RNA 分子 量标准参照物带型锐利而 poly（A）+mRNA 为一 模糊带型，由许多长度

16、范围从 500 碱基以下至 5k b 以上的各种 mRNA 共同组成，mRNA 的平均长 度约为 2kb。四、杂交和放射自显影四、杂交和放射自显影固定于滤膜上的 RNA 的预杂交、杂胶及淋洗等 条件，与 DNA 杂交的相应条件基本相同。现简述 如下：1、用下列两种溶液之一进行预杂交，时间 1-2小时。若于 42进行，应采用：50%甲酰胺5xSSPE2xDenhardt 试剂0.1%SDS若于 68进行，应采用：6xSSC2xDenhardt 试剂0.1%SDS2、在预杂交液中加入变性的放射性标记探针， 如欲检测低丰度 mRNA， 所用探针的量至少为 0. 1ug，其放射性比活度应大于 2x108计数/（分ug ）在适宜的温度条件下继续温育 16-24 小时。切 记 RNA 只与双链 DNA 中一条单链互补，因此如 用单链探针， 则必须是能与 RNA 互补的一条单 链。3、用 1xSSC、0.1%SDS 于室温洗漠 20 分钟 ，随后用 0.2xSSX、0.1%SDS 于 68洗膜 3 次每次 20 分钟。4、用 X 光片（Kodak XAR