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1、开题报告开题报告课题名称：腹腔镜中低位直肠癌根治术临床可行性分析及对肿瘤微灶转移的影响课题负责人：负责人所在单位：填表日期：2007 年 7 月1.1.选题的来源、目的、意义和基本内容选题的来源、目的、意义和基本内容1.11.1 选题来源选题来源直肠癌是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势1。尽管化疗、放疗以及生物治疗等方法不断进步，外科手术切除仍然是目前直肠癌唯一的治愈手段2。经过一个多世纪的努力，外科治疗的技术有了长足的进步。随着应用解剖学的发展和外科手术的不断探索，全直肠系膜切除(total mesorectal excision,TME)已经成为直肠癌根治手术
2、的原则之一。长期以来，传统开腹手术是大肠癌手术的主要选择。但是，开腹手术会造成较大的创伤。在不损害恶性肿瘤患者长期预后的前提下尽量减少创伤并最大程度的保留功能是目前肿瘤外科治疗的发展趋势之一。进入 21 世纪以来，微创外科技术，特别是腹腔镜技术得到了迅速发展，在诸多领域大有取代传统开腹手术之势。目前腹腔镜胆囊切除术(LC)已经成为胆囊切除术的“金标准” 。但是，相对于 LC，腹腔镜直肠癌手术发展相对滞后，主要是因为人们对其存在诸多顾虑。其一，由于直肠癌解剖学的特殊性，腹腔镜直肠癌需要更高的手术技巧;其二，目前腹腔镜直肠癌手术存在诸多并发症，其微创的优势远不及 LC 之于开腹胆囊切除术的优势显著
3、;其三，腹腔镜结直肠癌手术除有传统开腹手术的并发症外，还有诸如气栓，截孔病等腹腔镜特有的手术并发症;其四，腹腔镜直肠癌手术较开腹手术更为复杂，是否能实现“微创”尚难定论;其五，肿瘤手术的原则首先是根治，腹腔镜操作远比开腹困难，能否达到“根治”效果是评价这一手术的最根本问题3。中低位直肠癌手术解剖学的特殊性和其切除要求的严苛性给腹腔镜技术带来了挑战，其应用价值远不如腹腔镜结肠癌手术那样受到肯定，2005 年美国结直肠外科医师协会(ASCRS)发布:“由于缺乏 5 年生存的数据，同意腹腔镜用于可根治肿瘤的直肠切除为时尚早”4。然而，另一方面，中国，日本和韩国等地的医生在腹腔镜中低位直肠癌手术方面积
4、累了相当丰富的经验，在一些发展较好的中心，腹腔镜中低位直肠癌手术甚至己经成为日常临床工作。近年来，一些新的临床研究数据也相继发表，对普遍关心的问题作出了评价，人们期待着重新审视腹腔镜在中低位直肠癌外科治疗中的价值5。随着腹腔镜技术的不断进步与日益成熟，以及腹腔镜设备的更新应用，它们在促进腹部微创外科的发展中起了重要的作用6由于腹腔镜直肠癌根治术在安全性等方面存在着一些争议，其普及仍比较有限.但腹腔镜直肠癌根治术具有众多优点，在临床越来越受重视，其优点如下:腹腔镜能更准确清晰的判断出盆筋膜脏壁层疏松结缔组织间隙，易于操作，具有更清晰的视野;腹腔镜改变了开腹手术的视角，能更精确定位解剖位置，更有利
5、于手术止血，减少术中出血，其良好的照明也可保证术中很少发生出血.腹腔镜能放大局部术野，更利于清扫淋巴结，同时它能抵达狭窄的小骨盆，能很好的识别和保护盆腔生殖神经，避免了不必要的损伤:腹腔镜专用手术器械有利于术中助手的配合，提高了医生手术中的操作能力，腹腔镜的应用，能使更低位直肠游离出来，提高了患者保肛的几率，使得患者术后的生活质量得到明显提高，对改善患者的预后也有积极的作用。近年来发表的 Meta 分析文献有很多，其中也包括我国学者所做的研究7-9得出较为一致的意见是腹腔镜结直肠癌手术的近期效果肯定，但是多数随机对照试验(random controlled trails, RCT)未纳入中低位
6、直肠癌患者10，腹腔镜辅助中低位直肠癌根治术的临床应用尚缺乏足够的证据支持。因此，开展研究评价腹腔镜辅助中低位直肠癌根治术的可行性将有助于指导腹腔镜手术更合理的应用。1.21.2 研究目的：研究目的：（1）通过对腹腔镜直肠癌根治术和开腹直肠癌根治术的对比性研究分析腹腔镜手术对中低位直肠癌的治疗效果。（2）分析腹腔镜手术对中低位直肠癌患者外周血中 CK20mRNA 表达的影响，评价腹腔镜中低位直肠癌根治术对肿瘤细胞微灶转移的影响。（3）综合分析患者临床资料，探讨腹腔镜手术对中低位直肠癌预后的影响。1.31.3 研究意义：研究意义：目前，腹腔镜直肠癌手术的根治性、安全性、术后远期疗效及戳孔种植转移
7、仍是外科医师关注的问题。腹腔镜治疗中低位直肠癌需长时间的改进与完善，腹腔镜辅助中低位直肠癌根治术的临床应用尚缺乏足够的证据支持，但它具有微创外科技术共有的优点，并可取得和开腹手术同样的效果。因此，开展研究评价腹腔镜辅助中低位直肠癌根治术的可行性将有助于指导腹腔镜手术更合理的应用。1.41.4 基本内容：基本内容：为分析腹腔镜辅助中低位直肠癌根治术的研究现状，评价其短期的安全性和有效性，本研究设计了以下内容:第一部分腹腔镜中低位直肠癌根治术与开腹根治术短期疗效的前瞻性非随机对照研究。通过分析我院 2007 年 4 月至 2011 年 12 月间接受腹腔镜和开腹中低位直肠癌根治术患者的临床数据，探
8、讨腹腔镜中低位直肠癌根治术的短期安全性和有效性。第二部分腹腔镜手术对中低位直肠癌患者外周血中 CK20mRNA 表达的影响。以实时荧光定量 RT PCR (Real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction,Real-time RT PCR)技术检测两组患者术前 1 天和术后1 天患者外周静脉血中 CK20mRNA。评价腹腔镜中低位直肠癌根治术对肿瘤细胞微灶转移的影响。2 2 研究方案：研究方案：2.12.1 临床病理资料临床病理资料选择符合研究标准的于 2007 年 4 月至 2011 年 12 月间在
9、新乡医学院第一附属医院住院接受手术治疗并能行根治术的直肠癌患者 58 例，其中行开腹直肠癌根治患者 30 例，腹腔镜直肠癌根治患者 28 例。患者纳入标准:(1)术前病理确诊为单发原发性直肠癌或高级别上皮瘤变需行直肠癌根治术，且肿瘤下缘距离肛缘距离lOcm； (2)手术前患者未行内镜下切除，经肛门切除；(3)患者既往无恶性肿瘤病史；(4)非急性肠梗阻、出血或穿孔等急诊手术:(5)术前辅助检查(包括全胸片、腹部 B 超及 CT 等)未发现有远处转移；(6)未行预防性造屡;(7)既往无腹腔手术病史，术前未接受过辅助放化疗；(8)术中无肿瘤固定或侵犯周围组织或脏器而导致肿瘤无法切除；(9)能够获得完
10、整随访资料。2.12.1 腹腔镜器械设备腹腔镜器械设备腹腔镜系统（德国，Wolf 三晶片腹腔镜系统） ；单极电凝剪及各类分离钳、无创抓钳、Hemo-lock 血管夹由美国威克公司提供；GEN-300 超声刀、穿刺器及防滑套管、ATG45 腔镜切割缝合器、CDH29-33 圆形吻合器均由美国强生公司提供。2.22.2 实验室仪器设备实验室仪器设备超净工作台（江苏苏净集团） ；细胞培养瓶（美国 Costar 公司） ；水平电泳仪、凝胶成像仪（美国 Bio-Rad 公司） ；LightCycler 荧光定量 PCR 基因扩增仪（德国 Roche 公司） 。2.32.3 主要试剂主要试剂LB 培养基购
11、自美国 Gibco 公司； cDNA 首链合成试剂盒购自 Fermentas 公司；快速胶回收试剂盒购自 Invitrogen 公司；pMD 19-T 载体连接试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自 Takara 公司；GAPDH mRNA、 CK20mRNA 引物及探针均购自上海生物工程有限公司；Trizol 总 RNA 提取试剂盒、Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液、DNTPs 均购自上海申能博彩公司。2.32.3 研究方法研究方法2.3.12.3.1 开腹手术开腹手术: :按照常规标准直肠癌根治术式进行。2.3.22.3.2 腹腔镜手术腹腔镜手术: :建立操作平台:取患者取膀胱截石位，头低 3
12、0 度，均采用气管插管，静吸复合全身麻醉。于脐下皮褶处做环脐切口长约 12mm，逐层进入腹腔，直视下置入 12mm 套管，建立气腹，气腹压定为 12mmHg。经此套管插入 30腹腔镜。在腹腔镜监视下，于右侧腹直肌外缘骼前上棘水平稍下方，避开腹壁下动脉置入 12mm 套管作为主操作孔，另于右侧腹直肌外缘脐水平和左侧麦氏点附近各置入一个 5mm 套管作为副操作孔和助手操作孔。探查:仔细探查以确定手术方案，探查顺序和内容同开腹手术。结直肠游离及肿瘤切除和消化道重建:手术均遵循 Heald 提出的全直肠系膜切除(total mesorectal excision ,TME)原则。提起乙状结肠左侧的系膜
13、，切断乙状结肠与左侧腹膜的粘连，沿降、乙结肠左侧的黄白交界线(Toldts 线)向头侧切开腹膜，并向尾侧延长直至腹膜返折处。将结直肠向内牵拉翻转，充分游离左后方并注意识别和保护左输尿管。将肠管及系膜朝左前方牵引，张紧乙状结肠系膜，于骸呷前方的肠系膜右侧(亦呈黄白交界)切开腹膜，并向腹主动脉表面的肠系膜下动脉(inferior mesentericartery,IMA)根部(略呈隆起状)延长，下腹神经丛位于主动脉和骸呷的上面，注意保护这些结构。沿肠系膜下血管的走行清扫其周围淋巴结，将肠系膜下血管骨骼化，用 Hemolock 塑料血管夹高位夹闭肠系膜下血管后离断;先于右侧在骸骨呷水平用超声刀向下分
14、离出骸前间隙，切开右侧的直肠系膜根部之腹膜达腹膜返折水平，后方锐性分离过尾骨尖;再从左侧侧腹膜上分离乙状结肠及其系膜，打开左侧直肠系膜根部之腹膜与右侧在骸前间隙会师，直达左侧腹膜返折水平;在腹膜返折水平下，沿直肠前方的 Denonvi-lliers 筋膜间隙向下游离直肠前壁;再切断两侧的侧韧带并注意保护盆腔的自主神经，再沿直肠系膜侧壁与盆丛之间用超声刀锐性分离达肛提肌筋膜表面；保肛手术的病例术中助手用手指顶住肿瘤下缘的方法帮助术者定位，确定肿瘤下缘的关闭部位后用线性切割闭合器切断肠管;于左下腹作一 4cm 横行切口，用腹腔镜塑料套保护切口后取出肠段，于肿瘤上缘 10-15cm 处切断乙状结肠，
15、移去标本。近端结肠置入 29-32mm 吻合器钉座，荷包缝合。回纳肠段，重新建立气腹，吻合器经肛门进入在腔镜下行直肠乙状结肠低位端端吻合。Miles 手术:在游离直肠后在腔镜下用超声刀切断乙状结肠系膜，于直乙结肠交界处用切割闭合器切断结肠，肛侧断端经会阴部手术取出，左下腹穿刺孔予以扩大作为造疹口，拉出近侧断端行单腔造疹。会阴部手术及造痰方法同开腹手术。腹腔镜术中预防术后切口种植采用的具体方法:(1)保证截口与穿刺套管的密封，只允许 CO2从套管中排出；(2)拔除穿刺套管前先用碘伏冲洗套管，然后再尽量排尽腹腔内 CO2；(3)在标本移出腹腔前，以消毒塑料袋保护切口，于套内牵引出病变肠管并将其包裹
16、;(4)常规应用灭菌蒸馏水加 5-Fu 分别冲洗腹腔、所有截口及小切口。2.3.3 RT-PCR 技术检测患者手术前后外周血中技术检测患者手术前后外周血中 CK20mRNA 表达指数表达指数取材:接受研究患者分别于术前 1 天，术后 1 天抽取清晨空腹第 2 管(防止表皮细胞渗入) EDTA2 抗凝静脉血 5ml，用淋巴细胞分离液(Ficoll 分离液)分离获取单个核细胞，计数(5-10) 106 细胞加到 1mlTrizol 总 RNA 提取液的Eppendof 管中，混匀后-20冻存备用。RNA 提取及定量:采用 Trizol 一步法提取骨髓单个核细胞总 RNA，经凝胶成像系统观察，可见 28S, 185, SS 三条带，无 DNA 污染条带，无明显降解条带，核酸蛋白检测仪测定 RNA 样品的 OD260/OD280值，比值在 1.82.0 之间，表明提取的总 RNA 纯度较高，计算 RNA 含量。cDNA 链合成:RT-PCR 反应体积为 401，包括 SXPCR buffer 51，标本RNA
