前B细胞集落促进因子诱导正常人及重型先天性中性粒细胞减少症患者髓系细胞分化功能研究

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1、广西医科大学博士学位论文前B细胞集落促进因子诱导正常人及重型先天性中性粒细胞减少 症患者髓系细胞分化功能研究姓名：蓝丹申请学位级别：博士专业：儿科学指导教师：经承学;Karl Welte20060401博士学位论文前B 细胞集落促进因子诱导正常人及重型先天性中性粒细胞减少症患者髓系细胞分化功能研究英文缩写 A M LA N CC ，E B P nC E B P 8C R HC y NG C S FG C S F RG M C S FG N 【P SG S DI bH L AH S C TL G L英文缩写表英文全称A c u t em y e l o i dl e u k e m i aA b

2、 s o l u t en e u t r o p h i lc o u n tC C A A T e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n 一旺C C A A T e n h a n c e rb i n d i n gp r o t e i n 一C y t o k i n er e c e p t o rh o m o l o g yC y c l i cn e u t r o p e n i aG r a n u l o c y t ec o l o n y - s t i m u l a t i n gf a c t o rG r a n u

3、 l o c y t ec o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o rr e c e p t o rG r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ec o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o rG r a n u l o c y t e m a c r o p h a g ep r o g e n i t o rc e l lG l y c o g e ns t o r a g ed i s e a s eI bH u m a nl e u c o c y t ea n t i

4、g e nH a e m o p o i e t i cs t e mc e l lt r a n s p l a n t a t i o nL a r g eg r a n u l a rl y m p h o c y t es y n d r o m e中文全称急性髓细胞性白血病外周血中性粒细胞绝对计数C C A A T 增强子结合蛋白一aC C A A T 增强子结合蛋白- 细胞因子受体同源性周期性中性白细胞减少症粒细胞集落刺激因子粒细胞集落刺激因子受体粒细胞巨噬细胞集落刺激因子粒系巨噬系造血祖细胞糖原累积症I b 型人类体白细胞抗原造血干细胞移植大颗粒淋巴细胞综合征博士学位论文前B 细

5、胞集落促进因子诱导正常人及重型先天性中性粒细胞减少症患者髓系细胞分化功能研究I L 3I L 一7M C S FM D SM P 0N A DN A m P R T a s eN EN F 1P B E FP M N SS C FS C NS C N tS C IW A S PI n t e r l e u k i n 一3I n t e r l e u k i n 7 M a c r o p h a g e c o l o n ys t i m u l a t i n gf a c t o rM y e l o d y s p l a s t i cs y n d r o m eM y e

6、l o p e r o x i d a s eN i c o t i n a m i d e a d e n i n ed i n u c l e o t i d eN i e o t i n a m i d ep h o s p h o f i b o s y l t r a n s f e m s eN e u t r o p h i le l a s t a s eN u c l e a rf a c t o r1P r e - B - c e Uc o l o n y - e n h a n c i n gf a c t o rP o l y m o r p h o n u c l e

7、 a rn e u t r o p h i l sS t e mc e l l sf a c t o rS e v e r ec o n g e n i t a ln e u t r o p e n i aS e v e r eC h r o n i cN e u t r o p e n i aI n t e r n a t i o n a lR e g i s t r yS e v e r ec o m b i n e di m m u n o d e f i c i e n c yW i s k o t t A l d r i c hS y n d r o m ep r o t e i n

8、2多集落刺激因子，自介素3白介素一7巨噬细胞集落刺激因子骨髓增生异常综合征髓细胞过氧化物酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸烟酰胺磷酸核糖转移酶中性粒细胞弹性蛋白酶核因子l前B 细胞集落促进因子嗜中性多形核白细胞干细胞因子重症先天性中性粒细胞减少症重型慢性中性粒细胞减少症国际注册机构重症联合免疫缺陷病维一奥二氏综合征蛋白博士学位论文前B 细胞集落促进因子诱导正常人及重型先天性中性粒细胞减少症患者髓系细胞分化功能研究中文摘要目的：研究前B 细胞集落促进因子( P r e B c e l lc o l o n y e n h a n c i n gf a c t o r ，P B E F )诱导正常人以及重型先

9、天性中性粒细胞减少症患者( s e v e r ec o n g e n i t a ln e u t r o p e n i a ，S C N ) 的C D 3 4 + 细胞向髓系细胞分化功能。方法：1 、利用激光辅助骨髓涂片单个细胞采集技术及逆转录实时定量P C R 方法检测正常人骨髓中不同分化阶段髓系细胞P B E F 表达水平。2 、用逆转录实时定量P C R 及E L I S A 方法检测正常人的髓系细胞经粒细胞集落刺激因子( g r a n u l o c y t ec o l o n y s t i m u l a t i n gf a c t o r ，G - C S F )

10、体内、外刺激后P B E Fm R N A 表达水平、细胞培养液或血浆中P B E F 蛋白质水平，同时检测细胞烟酰胺腺嘌呤二核苷酸( N A D + ) 合成水平的变化，研究G C S F 刺激与P B E F 表达、N A D + 合成的关系。3 、用人类重组P B E F 体外刺激正常人的C D 3 4 + 细胞后，通过光学显微镜观察细胞形态学的变化、流式细胞术检测表面抗原C D l l b 、C D l 5 的表达以及逆转录实时定量P C R 检测细胞C E B P a 、C E B P e 、P U 1 和E L A 2 等基因m R N A 的表达，研究P B E F 胞外刺激与C

11、 D 3 4 + 细胞向髓系分化的关系。4 、正常人的C D 3 4 + 细胞经由L e n t i v i r u s 转导P B E F 基因后，光学显微镜观察细胞形态学的变化、流式细胞术检测表面抗原C D l l b 、C D l 5 的表达变化以及逆转录实时定量P C R 检测细胞C E B P a 、C E B P e 、P U 1 和E L A 2 等基因m R N A 的表达变化，研究P B E F 胞内过度表达与C D 3 4 + 细胞向髓系分化的关系。5 、用逆转录实时定量P C R 、E L I S A 方法以及共聚焦荧光显微镜断层扫描技术检测经长期G C S F 治疗的S

12、 C N 病人髓系细胞的P B E Fm R N A 、胞内蛋白质水平以及血浆蛋白质水平的变化，研究G C S F 治疗后S C N 病人髓系细胞“成熟障碍”的纠正与P B E F 表达变化的关系博士学位论文前B 细胞集落促进因子诱导正常人及重型先天性中性粒细胞减少症患者髓系细胞分化功能研究6 、体外G C S F * U 激S C N 病人的髓系细胞，逆转录实时定量P C R 、E L I S A方法以及共聚焦荧光显微镜断层扫描技术检测P B E F 的m R N A 、细胞内蛋白质水平的变化及细胞培养液蛋白质水平的变化，同时检测细胞N A D + 合成水平的变化，研究G C S F * U

13、 激与S C N 病人髓系细胞的P B E F 表达的关系。7 、体外用人类重组P B E F 刺激S C N 病人的C D 3 4 + 细胞，逆转录实时定量P C R 、E L I S A 方法检测S C N 病人的细胞的P B E Ft u R N A 及蛋白质的变化，并在光学显微镜下观察细胞形态学的变化、流式细胞术检测表面抗原C D l l b 、C D l 5 的表达变化以及逆转录实时定量P C R 检测细胞C E B P a 、C E B P e 、P U 1和E L A 2m R N A 等基因的表达变化，研究P B E F 诱导S C N 病人C D 3 4 + 细胞向髓系分化的

14、功能。8 、测定S C N 病人以及健康志愿者P B E F 基因启动子的序列结果：1 、正常人P B E F 基因的m R N A 表达量随着髓系细胞的分化而逐渐增高，至成熟的中性粒细胞阶段表达量达到了最高峰。2 、正常人的髓系细胞经G C S F 体内、外刺激后P B E F 的I n 】刚A 及蛋白质水平增高，同时细胞N A D + 合成增加。3 、正常人的C D 3 4 + 细胞经人类重组P B E F 体外刺激，或C D 3 4 + 细胞转导P B E F 基因后，均可分化为成熟的中性粒细胞。4 、经长期G C S F 治疗效果良好的S C N 病人的髓系细胞P B E Fm R N

15、 A 及细胞内、外蛋白质表达增高，而且与经G C S F 刺激后正常人以及其他类型的经长期G C S F 治疗的中性粒细胞减少症病人体内分离出的同类细胞相比，呈现更高的表达水平；但G C S F 治疗效果不佳的S C N 病人的髓系细胞P B E Fm R N A 及蛋白质表达无明显变化。5 、体外S C N 病人的髓系细胞经G C S F 刺激后P B E F 的m R N A 、细胞内蛋白质表达水平以及细胞N A D + 合成水平增高，而且与经G C S F 刺激后正常人体内分离出的同类细胞相比，呈现更高的表达水平。6 、S C N 病人的C D 3 4 + 细胞经体外用人类重组P B E

16、 F 刺激后，可向成熟的4辩 学位论文翦B 彝| 胞集嚣往述田子礴导正常人投重型先天槛中拄粒绑鹈减少箍患者髓系捆髓分纯功能研究中性粒细胞分化。7 S C N 病人P B E F 基因启动子序列无突变结论：l 、正常人自然状态下在髓系细胞分化过程中，P B E F 表达水平与细胞成熟度呈正楣关，P B E F 表达水平越离，缀胞越成熟。2 、正常入或S C N 病人，G - C S F 促进髓系细胞分化成熟是通过表达P B E F 、沿N A D + 依赖的途径进行的。3 、P B E F 可促遴正常人或S C N 病人的髓系细胞分化4 、长期应盾G C S F 治疗且获得A N C 键高的S C N 病人，在细胞实验中观察到的伴随P B E F 表达增高而至的N A D + 的水平增高的现象，揭示了G C S F诱导重建病人缺失豹粒系分纯功戆兹可戆枫搿。5 、应用G C S F 治疗且获得A N C 提高的S C N 病人P B E F 表达增高，而G C S F