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1、生物医学中生物医学中 NO 探究探究1、NO 的的生生物物化化学学NO 是一种难溶于水、高脂溶性的小分子气体，极易通过细胞膜扩散。它拥有额外电子，化学反应能力强，生物学半衰期为35s。体内 NO 是由 NO 合成酶(nitricoxidesynthase，NOS)催化 L-精氨酸 (L-Arg)转变为 L-瓜氨酸时产生的。NO 在多种细胞中均能生成，生成后很快被氧化成NO2-和 NO3-，从而失去生物学活性。 NOS 是 NO 反应通路的限速酶，根据其来源及作用特点，可分为神经元型(nNOS)、内皮型 (eNOS)和诱导型 (iNOS)3 种;根据其被提纯顺序及克隆结果，又可分为 3 种同工酶
2、，即同工酶 (nNOS)、同工酶 (iNOS)、同工酶 (eNOS)。nNOS 与 eNOS 在体内可连续表达，通过Ca2+内流及钙调蛋白 (CaM)激活，激活后产生短时效少量的NO;而 iNOS 则需要 -肿瘤坏死因子 (TNF-)、-干扰素(INF-)、白细胞介素 1(IL-1)、细胞脂多糖 (LPS)等诱导才表达，产生局部高浓度的 NO 而介导后继的长效反应 1。一般认为， iNOS 的激活不依赖于Ca2+/CaM，但目前 3 种 NOS 在 Ca2+/CaM 依赖性上的区别日趋模糊。NOS 的 C 端与细胞色素 P-450 还原酶有共同序列 2，具有显著同源性。 3种同工酶是不同的基因
3、产物，种属间NOS 氨基酸序列具有高度保守性，人类各同工酶之间序列同源性为50%60%，而不同种属动物间相同同工酶序列同源性大于90%。目前 3 种同工酶的 cDNA 结构已被克隆和表达。所表达的3 类 NOS 的 N端结构极其相似，可能与其L-Arg 结合位点和催化活性有关。利用特异性DNA探针已经证明，人NOS3 种同工酶基因分别位于12 号、 17 号和 7 号染色体，它们的基因结构已部分搞清，对基因中某些结构区域的功能也有了一定了解。通过某些细胞因子、酶类、 Ca2+/CaM 及激素等调控因子对NOS 基因表达影响的研究，阐明了 mRNA 稳定性是 NOS 活性的重要调节点 3，而且
4、NO 能反馈抑制 NOS的活性。 NO 的作用靶是鸟苷酸环化酶(GC)。NO 与含血红素的 GC 上 Fe2+结合，激活后的 GC 导致 cGMP 水平增加， cGMP 再作用于 cGMP 依赖的蛋白激酶及磷酸二酯酶，调节离子通道，使有关递质释放而发挥生理效应。NO 激活的 GC 可使 cGMP 生成速度加快 50200 倍。 NO 和 GC 的结合代表着一种新的广泛存在的将细胞外信息转导为邻近细胞内cGMP 的信息传递机制。 NO 对腺苷二磷酸(ADP)核苷基转移酶也有作用。此酶可将ADP 的核苷基团转移至线粒体蛋白与线粒体中酶蛋白的羧基上，使蛋白构象改变而发挥作用。影响NO 生物作用的主要
5、因素是 NO 的生物半衰期。另有报道，NO 能降低细胞内的游离Ca2+浓度，从而防止细胞内 Ca2+浓度过高，保护细胞 ;反过来， NO 生成又依赖于细胞内游离Ca2+，Ca2+对维持 NOS 活性是必需的。2、NO 对对机机体体主主要要系系统统的的作作用用2.1NO 对心脑血管系统的作用NO 是血管平滑肌扩张剂，可使血管舒张，血压下降。正常情况下，血管内皮细胞和心内膜释放少量的NO，维持适度的血流、血压和脑血管屏障通透性。NO 通过 cGMP 抑制血小板的凝集和粘附，发挥内源性抗血栓作用。 NO 是血管内环境稳定的重要分子，异常的NO 生物利用度与许多血管疾病有关 4。在病理情况下， NO
6、释放减少，内皮素增加，可导致血管舒缩功能调节失调、血小板凝聚和内皮细胞增殖，引起一系列心血管疾病，如高血压、血管痉挛、高胆固醇血症和动脉粥样硬化性心脏病等。低浓度NO 对充血性心衰、循环性休克、脑缺血、动脉粥样硬化和高血压等许多疾病有治疗作用。临床上应用的硝普钠 (SNP)、硝酸甘油等 NO 供体药物，都具有舒血管作用，同时还有更重要的细胞保护效应。 NO 供体保护心肌的主要机制是降低过氧化物酶活性，减少超氧自由基，进而减少中性粒细胞粘附于内皮和保护内皮机能;另一方面， NO 通过降低心肌对 -肾上腺素能刺激的反应性而使耗氧量减少5。NO 供体对脑、内脏、肾等各种血管床缺血再灌及休克治疗中的内
7、皮功能保护也有特殊作用。2.2NO 对神经系统的作用NO 是一种特殊的扩散性神经递质，不贮存于突触小泡内，既可作为突触前递质从神经末梢释放;也可作为突触后递质，从突触后膜释放。在外周神经系统中，NO 作为突触前递质从非肾上腺素能非胆碱能(NANC)神经元末梢释放。 NO 除直接作用外，还通过调节乙酰胆碱、儿茶酚胺、兴奋性和抑制性氨基酸、 5-羟色胺、组织胺等神经递质间接发挥作用6。NO 与学习记忆关系密切。海马中一些区域在重复刺激后可产生长时程突触增强(LTP)效应，NO 对维持 LTP 有重要作用。用SNP 可使海马突触效应持续增强，而向海马神经元注射 NOS 抑制剂 NG-硝基 -L-精氨
8、酸 (L-NNA)和用 Hb 结合 NO 都可阻断LTP。从 NO 入手将为寻找新型促智药及防治早老性痴呆病(AD)提供新思路。NO 与痛觉传导密切相关。给与NOS 抑制剂 L-N-硝基精氨甲酯 (L-NAME)后，小鼠在福尔马林足底注射法、热板法和乙酸导致的扭体模型上，均表现出明显且持久的抗伤害作用。但无炎症并发的急性和慢性疼痛似乎不依赖于NO7。NO 在嗅觉、视觉、触觉的感应传导中也发挥作用。NO 是阴茎勃起的主要递质，能增强性功能。用NOS 免疫组化技术，发现NOS 选择性地分布于支配大鼠阴茎平滑肌的神经元中。直接应用NO 和 L-Arg 会产生如神经受刺激一样的海绵体平滑肌松弛作用，而
9、NOS 抑制剂选择性地抑制肌松弛。NO 在中枢神经系统及其对某些神经递质释放的调节中有双重作用。eNOS 可舒张血管和增加脑血流而具有神经保护作用。 nNOS 活性增强可加剧神经元损伤。过量释放的NO 可诱发癫痫，导致脑损伤和记忆缺损。例如，AD 病人的大脑海马中NOS 阳性神经元数明显低于正常人。而帕金森氏综合症(PD)患者脑胶质细胞中iNOS 的表达与神经元损伤相关，其大量生成的NO 加剧了多巴胺 (DA)神经传导障碍。军用神经毒毒剂梭曼对小鼠的毒性可被Arg 增强，被 L-NAME 减弱，且有剂量反应关系，而且梭曼中毒后小鼠大脑、小脑、海马中NOS 活性增加 8。2.3NO 对免疫系统的
10、作用巨噬细胞、炎性中性粒细胞、组织中免疫细胞等被内毒素或 T 细胞激活，表达iN-OS 的 mRNA，生成的 iNOS 催化产生大量 NO。内源性 NO 是巨噬细胞杀伤靶细胞的信使分子，它通过非特异性免疫机制对抗侵入机体的微生物和病原体。肺和肝是机体循环路径中的主要免疫滤过器，其非特异性免疫功能依赖于 NO。NO 还具有免疫抑制作用，在植物血凝素刺激的淋巴细胞体外增殖反应中，从巨噬细胞产生的NO 可抑制淋巴细胞增殖反应。许多细胞因子，如 IL-1、IL-2、TNF 和 IFN 以及某些细菌内毒素可以单独或联合激活巨噬细胞产生NO，即正向调节。而另一些细胞因子如TGF-、IL-4、IL-10、巨
11、噬细胞灭活因子等可抑制巨噬细胞产生NO，即负向调节。巨噬细胞产生的NO 对某些细胞因子的产生也具有调节作用。由此可见，作为免疫调节因子，NO 的产生受细胞因子严密调节，处于复杂的细胞因子网络监视之中。2.4NO 对呼吸系统的作用NO 可使气管、支气管平滑肌松弛。低浓度(510-6)吸入 NO 或雾化吸入释放NO 的复合物是强有力的支气管扩张剂，可用于临床治疗支气管哮喘等疾病。 2010-6 的 NO 可有效预防成人呼吸窘迫综合征(ARDS)9，且在一定浓度范围内，浓度越高作用越明显。急性肺损伤时，由于LPS 及多种细胞因子的作用， iNOS 被激活，血浆及呼出气中NO 浓度升高。多量的内源性
12、NO 有双重作用，一方面通过血管平滑肌扩张、心肌收缩力下降、多种代谢酶功能紊乱等而具有损害作用;另一方面通过降低肺动脉压、减少血小板粘附及白细胞出游等发挥有利作用。但吸入适量NO 可选择性降低肺动脉高压，改善氧合作用，而对体循环无影响。在慢性支气管炎中，NO 生成也增多。目前，测量上呼吸道 NO 已成为一项新的诊断指标。另外，吸入NO 对早产儿和新生儿ARDS的救治也有效。最近发现，NO 是呼吸道上皮细胞离子通道的调节器，它在呼吸道疾病及其防御中发挥重要作用10。2.5NO 对消化系统的作用NO 是胃肠道 NANC 神经主要的抑制性神经递质之一，对食管收缩或舒张功能、食管括约肌功能及食管蠕动功
13、能有调控作用。免疫组织化学发现， NOS 分布在肠系膜神经丛、神经轴突和肠粘膜。NO 对胃肠道粘膜具有重要保护作用，如局部胃粘膜应用NO 溶液或硝酸甘油、 SNP 等，能减轻酒精引起的胃粘膜出血。临床上治疗胃溃疡的药物生胃酮，就是通过释放NO 而发挥对胃粘膜的保护作用的。应激性胃粘膜损伤时，粘膜血流量明显下降，粘膜通透性增加，血浆及粘膜NO 含量明显升高，用L-NAME 可明显加重粘膜损伤，并阻抑应激所致的血浆及粘膜内NO 含量升高，使粘膜血流量更趋下降，而L-Arg 可逆转 L-NAME 的作用 11。nNOS 和 eNOS 诱导产生的 NO，主要通过胃粘膜血流、上皮细胞分泌和屏障功能，保持
14、胃肠粘膜完整性;而 iNOS 诱导产生的NO 与胃肠道组织损伤有关 12。NO 对肝细胞功能、肝脏毒性和肝硬化的血液动力学也起重要调节作用。3、NO 与与寄寄生生虫虫感感染染NO 在疟原虫感染中的作用比较复杂。NO 一方面可杀伤疟原虫，对宿主起保护作用 ;另一方面过量生成的NO 又对宿主产生毒副作用。肝细胞对疟原虫子孢子的杀伤作用是 L-Arg 依赖性的。在疟原虫裂体增殖期间，宿主免疫细胞可产生NO 以杀伤裂殖子， L-Arg 的拮抗剂能减弱这种杀伤作用。感染疟原虫的小鼠血浆内的 NO2-水平明显高于正常小鼠 13。由于疟原虫诱导宿主细胞的NOS 活性明显升高，可引起脑微血管内皮细胞、巨噬细胞
15、等产生大量NO，NO 扩散到周围神经元，从而干扰正常的神经传导。用灭活的曼氏血吸虫尾蚴接种于小鼠，其皮肤内 iN-OS 表达水平明显升高。用NO 合成抑制剂氨基胍处理小鼠，其对血吸虫尾蚴感染的抵抗力明显降低14。山羊感染肝片吸虫第3 周，血浆中的 NO 和TNF- 开始升高，它们作为炎性介质可能参与了肝片吸虫对肝的损害过程。因为NO和 TNF- 对寄生虫也有抑杀作用，所以二者还与宿主抗肝片吸虫的机制有关15。NO 对细胞内克氏锥虫有杀伤作用。应用NOS 抑制剂 NG-单甲基 -L-精氨酸 (L-NMMA)后， NO 生成减少，杀伤锥虫作用减弱，锥虫血症发生率及动物死亡率均增加16。鸡感染球虫后
16、，血浆NO2-水平明显升高，但并不随球虫感染剂量的增加而增加，与虫株毒力大小也无直接关系17。中国农业大学从1997 年开始进行NO 与球虫感染关系研究，结果表明，雏鸡感染柔嫩艾美耳球虫或堆型艾美耳球虫后，血浆 NO2-水平均明显升高。 eNOS 抑制剂 L-NAME、L-NA 和 iNOS 抑制剂 L-AG 均能降低感染球虫雏鸡血浆NO2-水平和 NOS 活性。4、NO 与与肿肿瘤瘤NO 在肿瘤的发生、发展和转移等过程中均起作用，但对于不同的肿瘤类型，随时间、部位及局部浓度的不同，NO 的作用也很复杂。肺腺癌组织中，总NOS 活性比正常肺高。人卵巢肿瘤中有iNOS 表达，且其活性与肿瘤的分化程度相关，高分化卵巢癌 iNOS 活性比中分化和低分化者高。慢性肝炎继发肝癌(HCC)病人，血清中 NO 水平明显高于非HCC 者，也明显高于肝硬化并发HCC 者。而在乳腺癌中，NO 的水平则低于正常。肿瘤中少量NO 的产生可增加肿瘤血流量并促进血管新生，如转染了 NOS 基因的人结肠癌细胞
