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1、11.试述内毒素休克过程中 MAPK 通路和 NF-B 通路的激活在内毒素休克过程中的作用。答：内毒素休克是一种系统性炎症反应，表现为发热、低血压、DIC 和多器管功能衰竭等。革兰阴性菌、真菌、以及革兰阳性菌感染可导致中毒性休克。近年来对革兰阴性菌(G-)引起中毒性休克的机制已有比较深入的了解。认识到内毒素(endotoxin)及其脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)在启动体内免疫系统反应，导致中毒性休克中的重要性。Ulevitch 提出了 LPS 介导细胞激活或细胞将 LPS 摄入的分子机制的学说，并被大量在体(in vivo)和离体(in vitro)实验所证实。（一）
2、（一）内毒素休克过程中内毒素休克过程中 MAPKMAPK 通路的激活通路的激活MAPKs 是一个参与细胞内信号传导的蛋白激酶家族。多种细胞外刺激通过 MAPK 级联产生细胞反应，因此发现这些激酶参与 LPS 介导的细胞效应也是很自然的事情。至今已报道三种 MAPK 通路 ERK、JNK 和 p38 参与了 LPS 刺激引起的巨噬细胞激活。（1 1）ERKERK 通路通路ERK 亚族至少包括两个亚型：ERK1 和 ERK2。ERK 通路首先被证实在 EGF、NGF 和 PDGF 等生长因子刺激引起的细胞反应中起重要调控作用。然而，研究发现 ERK 通路还参与应激刺激、细菌产物、炎症介质等引起的细
3、胞反应，表明 ERK 通路的激活与炎症反应也有着密切关系。ERKs 可能参与了 LPS 处理导致的细胞因子合成的信号通路。ERK 是发现的可被 LPS 激活的第一组 MAPK。LPS 刺激通过上游效应物，使 ERK 激活。刺激作用下 Ras 同 Raf-1 氨基末端发生相互作用，导致其在胞膜募集，并被磷酸化激活。Raf-1 一旦被激活，可磷酸化 MKK1(又称为 MEK1)，接之使 ERK 磷酸化。LPS 能强烈地激活所有这些 MAPK。（2 2）JNKJNK 通路通路除了被生长因子激活外，JNK 通路还能被 LPS、如 TNF-、IL-1、紫外线、射线、热休克、细胞外高渗及DNA 变性剂等激
4、活。目前 JNK 亚族已克隆了 3 个基因：JNK1，JNK2 和 JNK3，共包含至少 10 种剪切亚型。生长因子刺激激活 JNK 依赖于 Ha-Ras，而 TNF- 和 IL-1 等致炎细胞因子则通过 Ha-Ras 非依赖性方式激活 JNK。JNK 被激活后，转而磷酸化转录因子 c-Jun 氨基末端的特定位点。c-Jun 是序列特异性转录激活因子 AP-1 的成分之一。磷酸化的 c-Jun 通过诱导同源或异源二聚体形成，与 AP-1 位点的顺式作用元件结合而启动某些效应基因的转录。还发现其它转录因子，包括 ATF2 和 三元复合物因子是 JNK 的下游作用底物。TCF 介导 c-fos 表
5、达，也可影响 c-Jun/fos 三聚体形成，这可能影响 AP-1 结合活性。（3 3）p38p38 MAPKMAPK 通路通路 p38 是在鉴定巨噬细胞和前 B 细胞中对 LPS 反应，发生酪氨酸磷酸化蛋白的研究中首次分离和克隆的。在筛选抑制炎症因子生成的化合物时发现一族吡啶-异咪哒唑化合物能够明显抑制 IL-1 和 TNF- 的生成。该类化合物能够与细胞内两个非常相似的 MAPK 同源体结合，被称为 CSBP1/2。CSAID 通过与 CSBP 结合并抑制其激酶活性而显著减少细胞因子的生成。测序证实 CSBP1/2 与小鼠 p38 MAPK 为同一基因。除了 LPS 之外，生血细胞因子，如
6、促红细胞生成素 (EPO)和白细胞介素 3 (IL-3)、致炎细胞因子、细菌成分、紫外线照射、细胞外高渗、H2O2、热休克等刺激都能激活这条通路。（4 4）ERK5ERK5 通路通路ERK5/BMK1 至今只发现了一个亚型，能被 TNF-、H2O2、细胞外高渗等刺激激活，说明该通路可能也参与某些条件下的炎症反应调控。（二）内毒素休克过程中（二）内毒素休克过程中 NF-NF- B B 的激活：的激活：NF-B 是一种普遍存在的转录因子。对 LPS 和 TNF- 等各种刺激反应而上调。LPS 刺激可使组织中 NF-B激活，用 NF-B 选择性抑制剂 PDTC 作用可减少 LPS 刺激诱导的 NO
7、合成，防止内毒素休克相关的系统低血压发生，这表明 NF-B 在内毒素休克中具有重要的作用。而且几乎所有的内毒素休克的主要致病基因如TNF-、IL-1、IL-6、IL-8、iNOS 和环氧合酶 都包含有 NF-B 的启动子元件。然而 C3H/HeJ LPS 低反应鼠的巨噬细胞不产生 TNF-，但可对 LPS 反应激活正常水平的 NF-B，表明 LPS 介导的细胞效应并不能单归于 NF-B 的作用。NF-B 包括 p50/105、p65(Rel A)、p52/100 和 Rel B 几种蛋白，这些蛋白通过同源或异源二聚体形式产生不同的 NF-B 亚型。p50/p65 是哺乳动物最丰富的诱导性亚型。
8、抑制蛋白与 NF-B 结合使其在脑浆内以2失活形式存在，I-B 可封闭 NF-B 的移核信号，阻断其核移位。I-B 的 32 和 36 位丝氨酸磷酸化引发其泛化(ubiquitination)，通过蛋白酶通路导致其降解，促进 NF-B 核转位以调节反应性基因。最近对导致I-B 磷酶化的过程进行了大量研究，发现 I-B 被一种大分子复合物 I-B 激酶(IKK)激活。该复合物包含两种蛋白 IKK-1 和 IKK-2 都具有亮氨酸拉链和螺旋-弯曲-螺旋模块，可形成异源二聚体。一旦被上游激酶激活，IKK 可磷酸化 I-B 的 32 和 36 位丝氨酸激发其降解。最近发现的一种蛋白激酶可能负责对 IK
9、K 的激活。NIK 同几种 MAPKKK，包括 MEKK1，具有同源性。NIK 与 TRAF2相互作用，TRAF2是一种与 p55 和 p75 TNF 受体结合的 TNF 受体相关的因子，可能参与了 TNF- 介导的 NF-B 激活。另一方面，MEKK1 作为 JNK的上游激活物已表明能够离体或在体内激活 NF-B。这可能是通过 MEKK1 磷酸化高分子量 IKK 复合物，导致泛素依赖性 IK-B 磷酸化，带来 I-B 降解和 NF-B 激活。LPS 刺激的巨噬细胞可检测到 IKK-1 和 IKK-2的激活。然而 MEKK1 在内毒素性休克中的作用以及 LPS 介导的 NF-B 激活过程中 I
10、KK 的上游信号元件仍未确定。发现 LPS 刺激的 NF-B 活性既依赖于蛋白酶活性也依赖于酪氨酸激酶活性，提示 LPS 通过磷酸化介导 I-B 蛋白降解来激活 NF-B。2.钙信号通过何种机制实现其对机体多种功能调节的？答：胞质钙作为信使对细胞各种生理活动具有广泛调控作用。早期的研究揭示, 钙在肌肉收缩, 激素、消化酶类和神经递质的释放中起重要作用; 近期的研究发现, 钙参与更广泛的生理过程, 如生物膜通透性及细胞兴奋性的控制、细胞代谢、细胞形态的维持、细胞周期的调控以及生殖细胞的成熟和受精等。经典的钙信号模型假设, 细胞内游离钙浓度的升高是引起细胞功能变化的主要原因。但是, 越来越多的实验
11、证据说明, 细胞对胞外信号产生应答反应时, 胞浆内游离钙浓度仅表现一过性升高, 很快恢复原始水平, 而细胞反应却持续很长时间, 非经典钙信号模型所能解释。钙循环、钙波和钙振荡的发现更改变了科学家对钙信号的探索视角, 从而对其作用机制有了较全面的了解。1. 细胞膜上的钙运输系统1. 1 钙通道细胞内游离钙离子浓度 Ca2+ i 升高, 可触发肌肉收缩、递质释放和激素分泌等生理活动。胞外钙离子内流是 Ca2+ i 升高的主要原因之一。钙内流主要通过细胞膜上三类钙通道实现: 电压依赖性钙通道、受体操纵性钙通道和机械操纵性钙通道。1. 2 钙泵和Na+ / Ca2+ 交换子细胞兴奋时, 钙进入细胞。虽
12、然细胞内存在多种钙缓冲系统, 但从胞外流入的钙终究必须排至胞外才能维持细胞的正常活动。行使钙外流功能的是存在于细胞膜上的两种蛋白: 钙泵和钠/ 钙交换子。细胞处于静息状态时, 钙外流主要由钙泵承担, 当细胞受刺激引起钙内流增加后, 钠/ 钙交换子活动增强, 快速将细胞内多余钙排除。2. 细胞质中钙缓冲系统细胞质中存在多种可溶性钙结合蛋白( calcium-binding protein, CaBP) , 能对胞质游离钙离子浓度变化作出快速反应, 起着重要的钙缓冲作用。3. 钙池膜上的钙运输系统3. 1 钙通道与钙释放细胞中最主要的钙池是内质网( ER) / 肌浆网( SR) 。ER/ SR 以
13、两种方式释放钙: 磷酸肌醇介导的钙释放和电压介导的钙释放3. 1. 1 IP3 受体介导的钙释放。IP3 作为第二信使,通过调节IP3 敏感钙池( IP3-sensit iv e calciumpool , 3IsCaP) , 在多种细胞活动中起重要作用。IP3 在质膜上产生后很快扩散到胞质中。3. 1. 2 兰诺定受体介导的钙释放细胞内还存在IP3 CICR 理论的要点是: 肌膜去激化引起的钙内流使胞质内Ca2+ 浓度升高, 激活SR 释放储存钙, 从而引起肌肉收缩。3. 2 钙泵在外分泌腺细胞的IisCaP 膜上存在一种对钒酸盐敏感的钙泵, 将胞质中的Ca2+ 摄入钙池内。3. 3 H+
14、/ Ca2+ 交换子在外分泌腺细胞的IsCaP 膜上有多种类型氢泵, 它们可以消耗AT P, 将胞质中的H+摄入钙池中, 形成钙池内外的H+ 浓度梯度。H+ 浓度梯度促使H+ / Ca2+ 交换, 使Ca2+ 被摄入IsCaP, 钙池内的H+ 外流。4. 胞内钙信号作用机制4. 1 钙跨质膜循环钙循环引起质膜下钙离子浓度增加, 激活PKC, 从而提高PKC磷酸化其它蛋白的效率。PKC 的靶分子仍然是蛋白激酶, PKC 通过一系列蛋白激酶的级联作用, 使多种蛋白质磷酸化, 从而介导持久性的细胞反应。4. 2 钙波/ 钙振荡钙信号常表现为时空异质性。钙波发生的典型模式是在某一点释放钙, 然后以51
15、00um/ s 的速度向周围传播。钙波的产生和传播是由IP3 介导的钙释放引起的。5 胞质钙信号的生物功能细胞内钙离子浓度升高后, 即与CaM 结合, 激活多种蛋白激酶( 如腺苷环化酶, 磷酸二酯酶、Ca2+ / 钙调蛋白蛋白激酶11 等) 、蛋白水解酶、核酸酶等, 从而调节细胞代谢、细胞周期等。5. 1 钙在细胞内吞和外排中的作用Ca2+ 在形成内吞和外排小泡过程中有重要作用, 并且是通过Ca2+ -CaM 复合体介导的。内吞和外排小泡的外部有Ca2+ -CaM 结合位点。神经递质的释放就是由Ca2+ -CaM介导的。5. 2 钙在细胞骨架组装中的作用Ca2+ 对细胞骨架的调节作用是通过Ca
16、M 依赖性激酶的磷酸化实现的。5. 3 钙在细胞分裂和增殖中的作用Ca2+ 在细胞有丝分裂中作用的研究较多集中在淋巴细胞。在这些细胞中, 外源植物凝集素与特异受体的结合需要Ca2+ 的存在。胞内Ca2+ 浓度增加诱发的有丝分裂也是通过CaM 介导的。5. 4 钙在受精过程中的作用精子和卵子的成熟及受精与Ca2+ 密切相关。精子进入卵细胞后引起的一个反应是卵内Ca2+ 浓度瞬间提高。Ca2+ 浓度提高首先出现于精卵融合处, 然后以波的形式传播到卵的对侧, 这种钙波对卵的活化具有重要作用。钙波之后紧随一系列重复的Ca2+ 振荡。5. 5 钙在神经系统中的作用神经系统是信号传递和整合的中心。Ca2+ 作为一种泛在的信使, 在神经系统的信号传输以及整合调节等生理活动中扮演着不可替代的角色。神经元是一种特异分化的细胞, 人们常在神经元及其支持细胞中发现特殊的钙通道、钙库。3.举例说明蛋白质组学技术在脓毒症功能基因组学研究领域的主要作用。答：见综述“蛋白质组学在脓毒症研究中的最新进展”
