[理学]10-11生化实验

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1、实验一、糖的呈色反应和定性鉴定实验一、糖的呈色反应和定性鉴定目的要求目的要求 (1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。 (2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。 . Molish 反应反应-萘酚反应萘酚反应 实验原理实验原理 糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与 -萘酚作用形成紫红色复合物，在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环，因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外，各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此，阴性反应证明没有糖类物质的存在；而阳性反应，则说明有糖存在的可能性，需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 试剂

2、试剂 Molish 试剂：取 5g -萘酚用 95%乙醇溶解至 100mL，临用前配制，棕色瓶保存。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管，编号，分别加入各待测糖溶液 1 mL，然后加两滴 Molish 试剂，摇匀。倾斜试管，沿管壁小心加入约 1mL 浓硫酸，切勿摇动，小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液，重复一遍，观察结果。 . 蒽酮反应蒽酮反应 实验原理实验原理 糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮（10-酮-9，10-二氢蒽）作用生成蓝绿色复合物。 试剂试剂 蒽酮试剂：取 0.2g 蒽酮溶于 100mL 浓硫酸中，当日配制。 待

3、测糖溶液，同 Molish 试验。 操作方法操作方法 1取试管，编号，均加入 1mL 蒽酮溶液，再向各管滴加 2 3 滴待测糖溶液，充分混匀，观察各管颜色变化并记录。 . 酮糖的酮糖的 Seliwanoff 反应反应 实验原理实验原理 该反应是鉴定酮糖的特殊反应。 酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。 后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物，反应仅需 20-30 秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸，才产生微弱的阳性反应。 试剂试剂 Sediwanoff 试剂：0.5g 间苯二酚溶于 1 升盐酸（H2OHCl=21）(V/V)中，临用前配制。 1%葡萄糖；1%蔗糖；1%果糖。 操作方法操作方法

4、取试管，编号，各加入 Sediwanoff 试剂 1mL，再依次分别加入待测糖溶液各 4 滴，混匀，同时放入沸水浴中，比较各管颜色的变化过程。 . Fehling 试验 实验原理实验原理 费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。 硫酸铜与碱溶液混合加热， 则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在，则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。 为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀，Fehlin 试剂中加入酒石酸钾钠，它与 Cu2形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子，该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂，它不于酮和芳香醛发生反应。 试剂试剂

5、 试剂甲：称取 34.5g 硫酸铜溶于 500mL 蒸馏水中。 试剂乙： 称取 125g NaOH 137g 酒石酸钾钠溶于 500mL 蒸馏水中， 贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前，将试剂甲和试剂乙等量混合。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管，编号，各加入 Fehlin 试剂甲和乙 1mL。摇匀后，分别加入 4 滴待测糖溶液，置沸水浴中加热 2 3min，取出冷却，观察沉淀和颜色变化。 . Benedict 试验试验 2实验原理实验原理 Benedict 试剂是 Fehling 试剂的改良。Benedict 试剂利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂，其碱性较

6、Fehling 试剂弱，灵敏度高，干扰因素少。 试剂试剂 Benedict 试剂：将 170g 柠檬酸钠和 100g 无水碳酸钠溶于 800mL 水中；另将 17g 硫酸铜溶于 100mL 热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中，边加边搅，最后定容至1000mL。 该试剂可长期使用。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管，编号，分别加入 2mL Benedict 试剂和 4 滴待测糖溶液，沸水浴中加热 5 分钟，取出后冷却，观察各管中的颜色变化。 . Barfoed 试验试验 实验原理实验原理 在酸性溶液中，单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Ba

7、rfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜，时间约为 3 分钟，而还原二糖则需 20 分钟左右。所以，该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长，非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。 试剂试剂 Barfoed 试剂：16.7g 乙酸铜溶于近 200mL 水中，加 1.5mL 冰醋酸，定容至 250mL 即可。 1%葡萄糖溶液；1%蔗糖溶液；1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管，编号，分别加入 2mL Barfoed 试剂和 2 3 滴待测糖溶液，煮沸 2-3 分钟，放置 20 分钟以上，比较各管的颜色变化。 注意事项注意事项 （1）Mo

8、lish反应非常灵敏，0.001葡萄糖和 0.0001蔗糖即能呈现阳性反应。因此，不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时，由于浓硫酸对它的焦化作用，将呈现红色及褐色而不呈紫色，需稀释后再做。 （2）果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速，呈鲜红色，而葡萄糖所需时间较长，且只能产生3黄色至淡黄色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应，戊糖经酸脱水生成糠醛，与间苯二酚缩合，生成绿色至蓝色产物。 （3）酮基本身没有还原性，只有在变成烯醇式后，才显示还原作用。 （4）糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小，Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时，生成的Cu2O颗粒较小，

9、呈黄绿色；反应速度慢时，生成的Cu2O颗粒较大，呈红色。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计，而不能依据沉淀的颜色来判断。 （5）Barfoed 反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部，溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现。 思考题 思考题 1. 列表总结和比较本实验六种颜色反应的原理和应用。 2. 运用本实验的方法，设计一个鉴定未知糖的方案。 4实验二、实验二、总糖和还原糖的测定总糖和还原糖的测定3,5二硝基水杨酸法二硝基水杨酸法 目的要求目的要求 掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用比色法测定还原糖的方法。 实验原理实验原理 在 NaOH 和丙三醇存在下，3,5二硝基水杨酸（D

10、NS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色，在 540nm 波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内， 还原糖的量与光吸收值呈线性关系， 利用比色法可测定样品中的含糖量。 试剂和器材试剂和器材 一、试剂一、试剂 3,5二硝基水杨酸 （DNS） 试剂： 称取 6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中， 溶解后移入 1000mL容量瓶中，加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 325mL，再加入 45g 丙三醇，摇匀，冷却后定容至1000mL。 葡萄糖标准溶液：准确称取干燥恒重的葡萄糖 200mg，加少量蒸馏水溶解后，以蒸馏水定容至 100mL，即含葡萄糖为 2.0

11、mg/mL。 6mol/L HCl：取 250mL 浓 HCl（35%38%）用蒸馏水稀释到 500mL。 碘碘化钾溶液：称取 5g 碘，10g 碘化钾溶于 100mL 蒸馏水中。 6mol/L NaOH：称取 120g NaOH 溶于 500mL 蒸馏水中。 0.1% 酚酞指示剂。 二、材料二、材料 藕粉，淀粉。 1三、器材三、器材 试管 1.515cm（13）, 3.020cm（1）；移液管 0.2mL（2），0.5mL（2），1mL（5）， 10mL（1）；水浴锅；电炉；分光光度计。 操作方法操作方法 一、葡萄糖标准曲线制作葡萄糖标准曲线制作 取 6 支 1. 5 cmm1.5cm 试管

12、，按下表加入 2.0mg/mL 葡萄糖标准液和蒸馏水。 管号 葡萄糖标准液（mL）蒸馏水(mL) 葡萄糖含量(mg/mL) A540 0 0 1 0 1 0.2 0.8 0.4 2 0.4 0.6 0.8 3 0.6 0.4 1.2 4 0.8 0.2 1.6 5 1 0 2 在上述试管中分别加入 DNS 试剂 2.0mL，于沸水浴中加热 2min 进行显色， 取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水 9.0mL，摇匀，在 540nm 波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 二、样品中还原糖的提取二、样品中还原糖的提取 准确称取 0.5g 藕粉，放

13、在 100mL 烧杯中，先以少量蒸馏水调成糊状，然后加入约 40mL 蒸馏水，混匀，于 50恒温水浴中保温 20min，不时搅拌，使还原糖浸出混。过滤，将滤液全部收集在 50mL 的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。 三、样品总糖的水解及提取三、样品总糖的水解及提取 准确称取 0.5g 淀粉，放在大试管中，加入 6M HCl 10mL，蒸馏水 15mL，在沸水浴中加热0.5h，取出 12 滴置于白瓷板上，加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全，则不呈现蓝色。水解毕，冷却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂，以 6M NaOH 溶液中和至溶液呈微红色，并定容到 100m

14、L，过滤取滤液 10mL 于 100mL 容量瓶中，定容至刻度，混匀，即为稀释 1000 倍的总糖水解液，用于总糖测定。 2四、样品中含糖量的测定四、样品中含糖量的测定 取 7 支 15mm150mm 试管，分别按下表加入试剂： 空白 还原糖 总糖 项目 0 1 2 3 4 5 6 样品溶液（mL） 1 1 1 1 1 1 1 3,5-二硝基水杨酸试剂（mL） 2 2 2 2 2 2 2 A540 加完试剂后，于沸水浴中加热 2min 进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在 540nm 波长处测定光吸收值。测定后，取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。

15、五、计算五、计算 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量： 式中：C还原糖或总糖提取液的浓度，mg/mL； V还原糖或总糖提取液的总体积，mL； m样品重量，g； 1000mg 换算成 g 的系数。 注意事项注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行，一起显色和比色 思考题思考题 1. 比色时为什么要设计空白管？ 2. 糖测定过程中的干扰物质有那些？如何除去？ 3实验十、实验十、 乳酸脱氢酶活力测定乳酸脱氢酶活力测定 目的要求目的要求 (1) 了解乳酸脱氢酶活性测定原理。 (2) 学习用比色法测定酶活性的方法。 实验原理实验原理 乳酸脱氢酶 （lactate dehydrogenase

16、 简称 LDH， EC.1.1.1.27, L乳酸： NAD+氧化还原酶）广泛存在于生物细胞内，是糖代谢酵解途径的关键酶之一，可催化下列可逆反应。 LDH 可溶于水或稀盐溶液。组织中 LDH 含量测定方法很多，其中紫外分光光度法更为简单、 快速。 鉴于 NADH, NAD+ 在 340nm 及 260nm 处有各自的最大吸收峰， 因此以 NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过 340nm 光吸收值的改变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油33 磷酸脱氢酶等。 本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙酮酸及 NADH 的溶液中，加入一定量乳酸脱氢酶提取液，观察 NADH 在反应过程中 340 nm 处光吸收减少值，减少越多，则 LDH 活力越高。其活力单位定义是：在 25，pH7.5 条件下每分钟 A340 下降值为 1.0的酶量为 1 个单位。 试剂和器材试剂和器材 一、试剂一