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1、实验一、糖的呈色反应和定性鉴定实验一、糖的呈色反应和定性鉴定目的要求目的要求 (1) 学习鉴定糖类及区分酮糖和醛糖的方法。 (2) 了解鉴定还原糖的方法及其原理。 . Molish 反应反应-萘酚反应萘酚反应 实验原理实验原理 糖在浓硫酸或浓盐酸的作用下脱水形成糠醛及其衍生物与 -萘酚作用形成紫红色复合物,在糖液和浓硫酸的液面间形成紫环,因此又称紫环反应。自由存在和结合存在的糖均呈阳性反应。此外,各种糠醛衍生物、葡萄糖醛酸以及丙酮、甲酸和乳酸均呈颜色近似的阳性反应。因此,阴性反应证明没有糖类物质的存在;而阳性反应,则说明有糖存在的可能性,需要进一步通过其他糖的定性试验才能确定有糖的存在。 试剂
2、试剂 Molish 试剂:取 5g -萘酚用 95%乙醇溶解至 100mL,临用前配制,棕色瓶保存。 1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管,编号,分别加入各待测糖溶液 1 mL,然后加两滴 Molish 试剂,摇匀。倾斜试管,沿管壁小心加入约 1mL 浓硫酸,切勿摇动,小心竖直后仔细观察两层液面交界处的颜色变化。用水代替糖溶液,重复一遍,观察结果。 . 蒽酮反应蒽酮反应 实验原理实验原理 糖经浓酸作用后生成的糠醛及其衍生物与蒽酮(10-酮-9,10-二氢蒽)作用生成蓝绿色复合物。 试剂试剂 蒽酮试剂:取 0.2g 蒽酮溶于 100mL 浓硫酸中,当日配制。 待
3、测糖溶液,同 Molish 试验。 操作方法操作方法 1取试管,编号,均加入 1mL 蒽酮溶液,再向各管滴加 2 3 滴待测糖溶液,充分混匀,观察各管颜色变化并记录。 . 酮糖的酮糖的 Seliwanoff 反应反应 实验原理实验原理 该反应是鉴定酮糖的特殊反应。 酮糖在酸的作用下较醛糖更易生成羟甲基糠醛。 后者与间苯二酚作用生成鲜红色复合物,反应仅需 20-30 秒。醛糖在浓度较高时或长时间煮沸,才产生微弱的阳性反应。 试剂试剂 Sediwanoff 试剂:0.5g 间苯二酚溶于 1 升盐酸(H2OHCl=21)(V/V)中,临用前配制。 1%葡萄糖;1%蔗糖;1%果糖。 操作方法操作方法
4、取试管,编号,各加入 Sediwanoff 试剂 1mL,再依次分别加入待测糖溶液各 4 滴,混匀,同时放入沸水浴中,比较各管颜色的变化过程。 . Fehling 试验 实验原理实验原理 费林试剂是含有硫酸铜和酒石酸钾钠的氢氧化钠溶液。 硫酸铜与碱溶液混合加热, 则生成黑色的氧化铜沉淀。若同时有还原糖存在,则产生黄色或砖红色的氧化亚铜沉淀。 为防止铜离子和碱反应生成氢氧化铜或碱性碳酸铜沉淀,Fehlin 试剂中加入酒石酸钾钠,它与 Cu2形成的酒石酸钾钠络合铜离子是可溶性的络离子,该反应是可逆的。平衡后溶液内保持一定浓度的氢氧化铜。费林试剂是一种弱的氧化剂,它不于酮和芳香醛发生反应。 试剂试剂
5、 试剂甲:称取 34.5g 硫酸铜溶于 500mL 蒸馏水中。 试剂乙: 称取 125g NaOH 137g 酒石酸钾钠溶于 500mL 蒸馏水中, 贮存于具橡皮塞玻璃瓶中。临用前,将试剂甲和试剂乙等量混合。 1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管,编号,各加入 Fehlin 试剂甲和乙 1mL。摇匀后,分别加入 4 滴待测糖溶液,置沸水浴中加热 2 3min,取出冷却,观察沉淀和颜色变化。 . Benedict 试验试验 2实验原理实验原理 Benedict 试剂是 Fehling 试剂的改良。Benedict 试剂利用柠檬酸作为 Cu2+的络合剂,其碱性较
6、Fehling 试剂弱,灵敏度高,干扰因素少。 试剂试剂 Benedict 试剂:将 170g 柠檬酸钠和 100g 无水碳酸钠溶于 800mL 水中;另将 17g 硫酸铜溶于 100mL 热水中。将硫酸铜溶液缓缓倾入柠檬酸钠-碳酸钠溶液中,边加边搅,最后定容至1000mL。 该试剂可长期使用。 1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管,编号,分别加入 2mL Benedict 试剂和 4 滴待测糖溶液,沸水浴中加热 5 分钟,取出后冷却,观察各管中的颜色变化。 . Barfoed 试验试验 实验原理实验原理 在酸性溶液中,单糖和还原二糖的还原速度有明显差异。Ba
7、rfoed试剂为弱酸性。单糖在Barfoed试剂的作用下能将Cu2+还原成砖红色的氧化亚铜,时间约为 3 分钟,而还原二糖则需 20 分钟左右。所以,该反应可用于区别单糖和还原二糖。当加热时间过长,非还原性二糖经水解后也能呈现阳性反应。 试剂试剂 Barfoed 试剂:16.7g 乙酸铜溶于近 200mL 水中,加 1.5mL 冰醋酸,定容至 250mL 即可。 1%葡萄糖溶液;1%蔗糖溶液;1%淀粉溶液。 操作方法操作方法 取试管,编号,分别加入 2mL Barfoed 试剂和 2 3 滴待测糖溶液,煮沸 2-3 分钟,放置 20 分钟以上,比较各管的颜色变化。 注意事项注意事项 (1)Mo
8、lish反应非常灵敏,0.001葡萄糖和 0.0001蔗糖即能呈现阳性反应。因此,不可在样品中混入纸屑等杂物。当果糖浓度过高时,由于浓硫酸对它的焦化作用,将呈现红色及褐色而不呈紫色,需稀释后再做。 (2)果糖与Seliwanoff试剂反应非常迅速,呈鲜红色,而葡萄糖所需时间较长,且只能产生3黄色至淡黄色。戊糖亦与Seliwanoff试剂反应,戊糖经酸脱水生成糠醛,与间苯二酚缩合,生成绿色至蓝色产物。 (3)酮基本身没有还原性,只有在变成烯醇式后,才显示还原作用。 (4)糖的还原作用生成氧化亚铜沉淀的颜色决定于颗粒的大小,Cu2O颗粒的大小又决定于反应速度。反应速度快时,生成的Cu2O颗粒较小,
9、呈黄绿色;反应速度慢时,生成的Cu2O颗粒较大,呈红色。溶液中还原糖的浓度可以从生成沉淀的多少来估计,而不能依据沉淀的颜色来判断。 (5)Barfoed 反应产生的Cu2O沉淀聚集在试管底部,溶液仍为深蓝色。应注意观察试管底部红色的出现。 思考题 思考题 1. 列表总结和比较本实验六种颜色反应的原理和应用。 2. 运用本实验的方法,设计一个鉴定未知糖的方案。 4实验二、实验二、总糖和还原糖的测定总糖和还原糖的测定3,5二硝基水杨酸法二硝基水杨酸法 目的要求目的要求 掌握还原糖和总糖的测定原理,学习用比色法测定还原糖的方法。 实验原理实验原理 在 NaOH 和丙三醇存在下,3,5二硝基水杨酸(D
10、NS)与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的 NaOH 碱性溶液中此化合物呈桔红色,在 540nm 波长处有最大吸收,在一定的浓度范围内, 还原糖的量与光吸收值呈线性关系, 利用比色法可测定样品中的含糖量。 试剂和器材试剂和器材 一、试剂一、试剂 3,5二硝基水杨酸 (DNS) 试剂: 称取 6.5g DNS 溶于少量热蒸馏水中, 溶解后移入 1000mL容量瓶中,加入 2mol/L 氢氧化钠溶液 325mL,再加入 45g 丙三醇,摇匀,冷却后定容至1000mL。 葡萄糖标准溶液:准确称取干燥恒重的葡萄糖 200mg,加少量蒸馏水溶解后,以蒸馏水定容至 100mL,即含葡萄糖为 2.0
11、mg/mL。 6mol/L HCl:取 250mL 浓 HCl(35%38%)用蒸馏水稀释到 500mL。 碘碘化钾溶液:称取 5g 碘,10g 碘化钾溶于 100mL 蒸馏水中。 6mol/L NaOH:称取 120g NaOH 溶于 500mL 蒸馏水中。 0.1% 酚酞指示剂。 二、材料二、材料 藕粉,淀粉。 1三、器材三、器材 试管 1.515cm(13), 3.020cm(1);移液管 0.2mL(2),0.5mL(2),1mL(5), 10mL(1);水浴锅;电炉;分光光度计。 操作方法操作方法 一、葡萄糖标准曲线制作葡萄糖标准曲线制作 取 6 支 1. 5 cmm1.5cm 试管
12、,按下表加入 2.0mg/mL 葡萄糖标准液和蒸馏水。 管号 葡萄糖标准液(mL)蒸馏水(mL) 葡萄糖含量(mg/mL) A540 0 0 1 0 1 0.2 0.8 0.4 2 0.4 0.6 0.8 3 0.6 0.4 1.2 4 0.8 0.2 1.6 5 1 0 2 在上述试管中分别加入 DNS 试剂 2.0mL,于沸水浴中加热 2min 进行显色, 取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水 9.0mL,摇匀,在 540nm 波长处测定光吸收值。以葡萄糖含量(mg/mL)为横坐标,光吸收值为纵坐标,绘制标准曲线。 二、样品中还原糖的提取二、样品中还原糖的提取 准确称取 0.5g 藕粉,放
13、在 100mL 烧杯中,先以少量蒸馏水调成糊状,然后加入约 40mL 蒸馏水,混匀,于 50恒温水浴中保温 20min,不时搅拌,使还原糖浸出混。过滤,将滤液全部收集在 50mL 的容量瓶中,用蒸馏水定容至刻度,即为还原糖提取液。 三、样品总糖的水解及提取三、样品总糖的水解及提取 准确称取 0.5g 淀粉,放在大试管中,加入 6M HCl 10mL,蒸馏水 15mL,在沸水浴中加热0.5h,取出 12 滴置于白瓷板上,加 1 滴 I-KI 溶液检查水解是否完全。如已水解完全,则不呈现蓝色。水解毕,冷却至室温后加入 1 滴酚酞指示剂,以 6M NaOH 溶液中和至溶液呈微红色,并定容到 100m
14、L,过滤取滤液 10mL 于 100mL 容量瓶中,定容至刻度,混匀,即为稀释 1000 倍的总糖水解液,用于总糖测定。 2四、样品中含糖量的测定四、样品中含糖量的测定 取 7 支 15mm150mm 试管,分别按下表加入试剂: 空白 还原糖 总糖 项目 0 1 2 3 4 5 6 样品溶液(mL) 1 1 1 1 1 1 1 3,5-二硝基水杨酸试剂(mL) 2 2 2 2 2 2 2 A540 加完试剂后,于沸水浴中加热 2min 进行显色,取出后用流动水迅速冷却,各加入蒸馏水9.0mL,摇匀,在 540nm 波长处测定光吸收值。测定后,取样品的光吸收平均值在标准曲线上查出相应的糖含量。
15、五、计算五、计算 按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量: 式中:C还原糖或总糖提取液的浓度,mg/mL; V还原糖或总糖提取液的总体积,mL; m样品重量,g; 1000mg 换算成 g 的系数。 注意事项注意事项 标准曲线制作与样品含糖量测定应同时进行,一起显色和比色 思考题思考题 1. 比色时为什么要设计空白管? 2. 糖测定过程中的干扰物质有那些?如何除去? 3实验十、实验十、 乳酸脱氢酶活力测定乳酸脱氢酶活力测定 目的要求目的要求 (1) 了解乳酸脱氢酶活性测定原理。 (2) 学习用比色法测定酶活性的方法。 实验原理实验原理 乳酸脱氢酶 (lactate dehydrogenase
16、 简称 LDH, EC.1.1.1.27, L乳酸: NAD+氧化还原酶)广泛存在于生物细胞内,是糖代谢酵解途径的关键酶之一,可催化下列可逆反应。 LDH 可溶于水或稀盐溶液。组织中 LDH 含量测定方法很多,其中紫外分光光度法更为简单、 快速。 鉴于 NADH, NAD+ 在 340nm 及 260nm 处有各自的最大吸收峰, 因此以 NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过 340nm 光吸收值的改变,定量测定酶活力,如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱氢酶、甘油33 磷酸脱氢酶等。 本实验测乳酸脱氢酶活力,是在一定条件下,向含丙酮酸及 NADH 的溶液中,加入一定量乳酸脱氢酶提取液,观察 NADH 在反应过程中 340 nm 处光吸收减少值,减少越多,则 LDH 活力越高。其活力单位定义是:在 25,pH7.5 条件下每分钟 A340 下降值为 1.0的酶量为 1 个单位。 试剂和器材试剂和器材 一、试剂一