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1、植物总植物总 DNA 提取方法提取方法赵红（山东师范大学生命科学学院） 摘要：利用液氮研磨植物幼芽，以苯酚氯仿异戊醇核糖核酸酶法提取了大豆、 菜豆、玉米等几种作物的总 DNA。所提取的 DNA 经紫外线分光光度计(牌子未知)检测及 0.8%的琼脂糖凝胶电泳，结果证明：该方法提取的植物总 DNA 纯度高，片段长度整齐， 约有 50Kb 左右，并且 DNA 收率很高。 关键词：DNA 提取；纯度；收率 近几年来，外源总 DNA 通过花粉管道直接导入农作物在多种植物上得到广泛的应用【1.2.3】 ，我们采用外源 DNA 直接导入大肠杆菌多年，该技术对 DNA 纯度有很高的要求。 都必须要求提高纯度和
2、大小要求整齐度。 本文将讲述利用苯酚氯仿异戊醇核糖核酸酶法提取几种植物总 DNA 的方法 及其结果。 材料和方法 （一）大豆、菜豆、玉米等 3 种作物共约 30 份材料。 （二） 提取方法 1、取暗发芽的植物幼芽 30g ,在液氮预冷的研钵中与液氮混合研磨成粉末状 ,加 30ml 提取 缓冲液4 ,0.65水浴 30 分钟,冰浴分钟 。 2.加等体积的饱合苯酚,轻轻摇匀 ,-20冰箱冻存 5 一 10 分钟,4000r/min 离心 5 分钟 ,吸出 水相 。 3、加等体积苯酚一氯仿一异戊醉（25：24:1）,摇匀 , 4000r/min 离心 5 分钟,吸出水相。 4、加等体积氯仿一异戊醇,
3、摇匀 ,4000r/min 离心 5 分钟 ,吸水相 。 5、约 2 倍体积的预冷无水乙醇沉淀 DNA,用玻璃棒绕出或离心沉降 ,得到 DNA 粗制品 ,略 凉干 。 6用 0.1*SSC 将沉淀的 DNA 溶解后加 1/10 体积的 10*SSC ,使其最终浓度达 1*SSC,JIA RNA 酶，使酶的最终浓度达 50 一 75 微克每毫升 37水浴保温 40 分钟 。 7、重复 2、3、4 程序。 8、加 2.5 倍体积的预冷无水乙醇沉淀 DN A,离心 DNA 沉降 ,弃去上清液 ,略凉干 ,得到精 制 DNA。 9、用 0.1*SSC 溶解后 ,加 1/10 体积的 10*SSC 。
4、然后用紫外分光光度计检测所提取的 DNA 纯度及收率 ,用 0.6%的琼脂糖凝胶电泳检 测其片段长度是否整齐一致.。 结果 1、该方法与氯仿一异戊醇法所提取的这几种作物 DNA 经紫外分光光度计检测结果如表格从表可以看出：本方法所提取的几种作物 DNA 均为 A260/A2302.0；A260/A2801.8,表明 DNA 纯度符合质量标准，蛋白质含量不超过 0.3%， （标准纯度中蛋白质 0.20.5%） ，而第 二个表格所示用氯仿异戊醇法提取的 DNA 多数不符合标准。 2、该方法提取的 DNA 经琼脂糖凝胶电泳检测，其片段长度为 50Kb 左右，可见提取效果 很好，片段长度大小一致，RN
5、A 以去除干净，并且没有 DNA 大量降解的情况。 3、DNA 的收率，经紫外分光光度计的 260nm 处得光吸收值可以计算出 DNA 收率 =（O.D260/0.02/L*稀释倍数*原液体积L 为比色杯首都；0.02 为每毫升溶液中含 1 微克 DNA 钠盐时的光密度；O.D260 为 260 纳米波长时光密度读数。 经此公式计算该方法提取的 DNA 均在 80-100 微克每克植物幼芽鲜重。 经紫外分光光度计的扫描结果可以看出是明显的 DNA 紫外吸收特征【5】 讨论 1、本实验采用饱和苯酚异戊醇去除组织蛋白，其效果比单纯氯仿异戊醇去除组织蛋白好 得多。主要由于低温下饱和苯酚与组织蛋白结合
6、使其变形的能力远高于 氯仿。 2、提取的 DNA 片段长度一致，RNA 去除干净，原因是提取过程中的操作要注意使各项能 混合均匀，使苯酚、氯仿异戊醇与 DNA 所在的水相能够充分接触即可，未必要剧烈震 荡以防止 DNA 分子由于机械剪切而断裂。参考文献：1. 王亚馥，戴灼华，1999：遗传学（第二版），高等教育出版社。 2. 刘祖洞，1994：遗传学（第二版），高等教育出版社。 3. 孙乃恩，孙东旭，朱德熙，1990：分子遗传学，南京大学出版社。 4. 韩贻仁，2001：分子细胞生物学（第二版），高等教育出版社。 5. 张玉静， 2000，分子遗传学，科学出版社。 6. 陈仁彪，冯波，1994：医学遗传学，上海科学技术文献出版社。 7. 王关林，方宏筠，2002：植物基因工程，科学出版社。 8. 荆玉辉，匡廷云，李德保主编，1995：植物分子生物学，科学出版社。 9. 林剑，1997：免疫遗传学，高等教育出版社。 10. 罗鹏主编，1996：遗传学应用。 11. 汤泽生，魏勇，程国忠，2002：质体遗传的数学模型与规律，四川科学技术出版社。 12. 沈珝琲,方福德，1996：真核生物基因表达，高等教育出版社。 13. 童克中，1996：基因及其表达，科学出版社。
