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1、液相色谱液相色谱-串联质谱法测定奶和奶制品中三聚氰胺残留串联质谱法测定奶和奶制品中三聚氰胺残留柳 菡1，孙宁宁1，杨雯筌1，刘 飞2，丁 涛1，徐锦忠11. 江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，南京，210001， 2. 赛默飞世尔科技上海有限公司色谱质谱部，上海，201206摘摘 要要 研究报导了高效液相色谱电喷雾串联质谱联用（HPLC/MS/MS）测定奶和奶制品中三聚氰胺残留的方法。三氯乙酸溶液沉淀样品中的蛋白，同时提取目标分析物，强阳离子固相萃取柱进一步富集净化后，利用液相色谱-电喷雾串联质谱测定。方法检测低限为 0.05 mg/kg， HPLC/MS/MS 添加回收率 72 87
2、 之间（基质匹配曲线校正） ，相对标准偏差（RSD）在 4.2 8.2。关键词关键词 三聚氰胺；奶和奶制品；液相色谱-串联质谱法Determination of melamine residues in milk and dairy products by liquid chromatography tandem mass spectrometryHan Liu1, Fei Liu2, Ningning Sun1, Wenquan Yang1, Tao Ding1, Jinzhong Xu1, 1 Animal, Plant and Food Inspection Center (APFIC)
3、 of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanjing 210001 2 Thermo Fisher Scientific, Shanghai，201206Abstracts: A method for analysis of melamine residues in milk and dairy products was developed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC/MS/MS). Trichloroacetic acid solutio
4、ns were used to precipitate proteins and dissociate the target analytes from sample matrix. After matrix purified by strong cation exchange solid phase extraction cartridge, analyses can be performed using HPLC/MS/MS in the selected reaction monitoring (SRM) mode. The limit of dection is 0.05 mg/kg
5、when using HPLC/MS/MS method. The mean recovery was 72 108 (matrix match calibration curve)and the standard deviation was 4.2 12.5 % by HPLC/MS/MS method.KEYWORDS: melamine; milk and dairy products; HPLC-MS/MS 9 月上旬，甘肃等地报告多例婴幼儿泌尿系统结石病例，调查结果表明，导致多名儿童患泌尿系统结石病的主要原因是患儿服用的奶粉中含有三聚氰胺。三聚氰胺是一种非食品化工原料，按照国家规定，
6、严禁用作食品添加物。部分婴幼儿配方奶粉中含有三聚氰胺，是不法分子为增加原料奶或奶粉的蛋白检测量而人为加入的。 三聚氰胺(melamine)简称三胺，是一种重要的氮杂环有机化工原料（结构式见图 1） ，主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂，广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业，目前是重要的尿素后加工产品。此外三聚氰胺还可以作阻燃剂、减水剂、甲醛清洁剂等。在部分亚洲国家，它也被用以制造化肥。同时三聚氰胺也是一种名为灭蝇胺的农药的代谢产物1。三聚氰胺属非食品用化学物质，食品中严禁添加，为提高奶和奶制品中蛋白质含量而加入大量三聚氰胺后，食用可导致泌尿系统疾病1。图 1 三聚氰胺化
7、学结构式 Fig.1 Chemical structure of melamine目前测定三聚氰胺的检测方法包括气相色谱法2、气质联用法3-4、高效液相色谱紫外或二极管阵列和串联质谱检测方法5-8。气质联用方法需要衍生化，过程比较繁琐。高效液相色谱配合紫外或二极管阵列由于其无需衍生化是目前最为常用的检测方法，但是抗干扰能力差，定量限难以满足要求。高效液相色谱串联质谱方法灵敏度高、抗干扰能力强，在三聚氰胺检测中具有优势。本文介绍了利用高效液相色谱电喷雾串联质谱联用（HPLC/MS/MS）测定奶和奶制品中三聚氰胺残留的方法。利用三氯乙酸溶液沉淀蛋白，阳离子交换固相萃取柱净化，进行高效液相色谱串联质
8、谱分析。经过大量样品分析结果表明，该方法快速、简单、抗干扰能力强，可以作为奶和奶制品中三聚氰胺残留的测定方法。1 实验部分实验部分1 11 1 仪器、试剂与材料仪器、试剂与材料Thermo Fisher TSQ Quantum 液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾电离源。甲醇(色谱纯，德国Merck)，乙腈(色谱纯，德国Merck)，三氯乙酸、氨水（28）、氢氧化钠(分析纯，南京化学试剂厂)、强阳离子交换柱（PCX，60mg 3mL 艾杰尔公司）；水为重蒸蒸馏水。三聚氰胺标准品购买自Sigma-Aldrich公司，纯度98。液态奶、奶粉、奶油等来自送检样品。1 12 2 测定条件测定条件
9、色谱条件：VARIAN C18色谱柱(150 mm2.1 mm i.d., 5 m)；流动相：10mmol/L醋酸铵水溶液甲醇（90：10），等度洗脱；流速0.20 mL/min。柱温：室温。进样体积：5L。分析时间：9 min。质谱条件：电喷雾离子化，正离子方式检测；毛细管温度350；喷雾电压4500 V；。三聚氰胺的质谱条件见表1。表 1 三聚氰胺质谱条件Table 1 ESI/MS/MS conditions of melamine 化合物母离子（m/z）子离子（m/z）碰撞能量/eV三聚氰胺127856821151.31.3 标准工作溶液的配制标准工作溶液的配制将三聚氰胺标准用甲醇水（
10、2:8）配制成1.0 g/L的单标储备液，避光冷藏保存。按实际检测需求，用阴性样品提取后吹干，添加一定量的标准溶液和1%三氯乙酸溶液配制相应浓度的标准工作溶液。1.4 样品前处理称取(1.000.02)g 样品于 50 mL 具塞离心管中，加入 1三氯乙酸溶液 10 mL，于液体混匀器上快速混合 30 s，超声波仪超声 30min。离心 5 min（8000 r/min），将上层清液过滤纸到干净离心管中，待净化。用 3 mL 甲醇、3 mL 水分别活化强阳离子交换柱，将滤液上柱，3 mL 水和 3mL 甲醇洗涤 SPE 小柱，3 mL 氨水甲醇（5 V:V）洗脱后，40水浴旋转蒸发至干。用 1
11、.0 mL 三氯乙酸溶液（1）定容后，过滤膜到进样瓶中，供液质联用仪测定。2 2 结果与讨论结果与讨论2.12.1 提取和净化条件的选择和优化提取和净化条件的选择和优化三聚氰胺极性较强，因此提取溶剂一般都使用极性较强的体系：缓冲水溶液、极性较强的有机溶剂或有机溶剂和水的混合溶剂。实验中比较了甲醇、甲醇水混合溶剂（1:1） 、乙腈、乙腈水混合溶剂（1:1） 、水、1三氯乙酸水溶液和 5 三氯乙酸水溶液作为提取溶剂，在阴性液态奶、奶粉、奶油中添加 0.5 mg/kg 浓度的三聚氰胺标准，比较不同提取溶剂的提取效果。结果发现纯有机溶剂直接提取回收率低，其余溶剂提取效率接近。在大量实际样品分析中发现，
12、有一些奶粉样品在使用水或有机和水混合溶剂提取后，十分粘稠，高速离心后亦无法过滤或过滤困难，且某些定容样品溶液在放置 2hr后出现沉淀，极容易导致色谱分析柱或分析预柱堵塞。1三氯乙酸溶液可以沉淀样品中的蛋白，避免该类现象的出现。在实验中，5和 10的三氯乙酸也曾经作为提取溶剂来使用，增加三氯乙酸的含量沉淀蛋白的效果更加明显，但是随着提取溶剂中三氯乙酸的含量的增加，对色谱分析中色谱峰形产生较大影响或者有不出峰的现象。最终选择 1三氯乙酸溶液作为提取溶剂使用。由于出口奶和奶制品成份复杂，直接三氯乙酸提取后高效液相色谱串联质谱测定时，容易出现离子源喷口污染比较严重导致灵敏度下降的现象，需要对样品进行净
13、化。三聚氰胺结构中含有三个伯胺基团，属于碱性化合物，在酸性条件下形成正离子，可以采用强阳离子固相萃取柱对样品进行净化，通过水和甲醇的清洗可以除去样品中水溶性的杂质、无机盐和非离子化的脂溶性杂质9。实验中发现利用强阳离子交换柱对样品进行净化后，可以较大限度的去除杂质，经过大量样品的分析，依然可以有效的防止样品过脏导致喷口污染的情况发生。2.22.2 色谱和质谱条件的优化色谱和质谱条件的优化三聚氰胺属于强极性化合物，在 C18色谱柱上几乎无保留，导致三聚氰胺与干扰物质无法分离，对检测带来干扰。为增加三聚氰胺在 C18色谱柱上保留，HPLCDAD 分析中一般都在流动相中加入离子对试剂，如庚烷磺酸钠、
14、辛烷磺酸钠8 和十二烷基磺酸钠等，与三聚氰胺形成中性离子对。在 HPLC/MS/MS测定中，流动相中只能使用挥发性的离子对试剂，如七氟正丁酸6。但是七氟正丁酸的使用，尽管可以改善三聚氰胺在普通 C18柱上的保留，但其会导致负离子无法正常测定，一般不建议使用，所以直接采用 90:10 的醋酸铵水溶液甲醇作为流动相。在实验中，发现使用 1三氯乙酸溶液定容样品和配制标准溶液，不仅可以使三聚氰胺在普通 C18分析柱起到良好的保留作用，且灵敏度有一定的上升。可能由于三氯乙酸也具有一定的离子对试剂的功能，可以使三聚氰胺在普通 C18分析柱产生保留，同时三氯乙酸的加入促使三聚氰胺在流动相中正离子化的预形成，
15、导致灵敏度上升。实验中发现使用 HPLC/MS/MS 测定时有基质抑制效应存在。用阴性液态奶、奶粉和奶油经过提取、SPE 净化定容后的溶液配制的标准溶液和直接配制的同浓度标准溶液相比，信号下降 3060左右，从而直接导致回收率偏低。为了补偿由于基质抑制效应而导致测定数值偏差问题，采用基质匹配曲线（Matrix matched calibration curve）来校正最终结果。2.32.3 线性范围和定量限线性范围和定量限阴性基质提取吹干后，加入一定量标准溶液和1%三氯乙酸，配制相应质量浓度的系列标准溶液，以待测物的质量浓度对峰面积做线性回归。结果表明，在浓度为0.02 g/mL2 g/mL时
16、相关系数(r )为0.9981，线性良好。该方法定量限为0.05mg/kg。2.42.4 回收率和精密度试验回收率和精密度试验在阴性液态奶、奶粉和奶油中添加三聚氰胺标准溶液，添加水平为0.05 mg/kg 、0.10mg/kg和0.20mg/kg，重复测定7次，计算其回收率和精密度，结果见表2。表2 回收率和精密度试验结果（n7） Table 2 Results of Recovery and precision test (n=7) 液态奶奶粉奶制品添加量/(mg/kg)检出量 (mg/kg)回收率 (%)RSD (%)检出量(mg/kg)回收率(%)RSD (%)检出量(mg/kg)回收率(%)RSD (%)0.050.037746.80.036728.20.039787.10.10.083834.50.077776.60.082824.70.20.174875.10.164825.10.158794.2图 2 奶粉中添加三聚氰胺
