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1、我的细胞培养计划我的细胞培养计划1、培养目的：培养目的：人牙周膜成纤维细胞人牙周膜成纤维细胞( ( humanhuman periodontalperiodontal ligamentfibroblasts,ligamentfibroblasts, PDLFs)PDLFs) 是牙周组织修复与重建的前体细胞之一是牙周组织修复与重建的前体细胞之一. ., , 在牙周病病理变在牙周病病理变化和转归中起着重要作用。因此化和转归中起着重要作用。因此, , 希望通过较简单的实验方法能较希望通过较简单的实验方法能较容易地培养出生长状态良好的容易地培养出生长状态良好的牙周膜成纤维细胞牙周膜成纤维细胞, ,为研
2、究牙周膜的生为研究牙周膜的生物学特点及各种与牙周膜成纤维细胞相关的实验研究提供较好的体物学特点及各种与牙周膜成纤维细胞相关的实验研究提供较好的体外模型。外模型。2 2、实验室条件：、实验室条件：超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计超净工作台、培养箱、倒置显微镜、冰箱、冷冻保存装置、细胞计数板和电子细胞计数仪、离心机、数板和电子细胞计数仪、离心机、PHPH计、天平、水纯化装置、高压计、天平、水纯化装置、高压蒸汽消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、蒸汽消毒装置、电热干燥箱、过滤除菌装置、手术器械、培养器皿、移液器、特殊用具、杂用品。移液器、特殊用具、杂用品
3、。DMEMDMEM 培养基培养基, , 胶原酶胶原酶, , 胰蛋白酶胰蛋白酶, , 小小牛血清牛血清, , ABCABC 免疫组化试剂盒。免疫组化试剂盒。3 3、培养方法：、培养方法：1 1）、培养基）、培养基: : DMEMDMEM 培养基培养基, , 内含内含10%10%小牛血清、青霉素小牛血清、青霉素100u/100u/ mlml、链霉素链霉素100100L Lg g / / mlml。2 2）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）；）具体操作方法及步骤（按实际操作分步列出）； 选择选择1212 岁岁 2525 岁因正畸或阻生拔牙患者岁因正畸或阻生拔牙患者, , X X 线显示无根尖病
4、变线显示无根尖病变, , 无骨质吸收无骨质吸收, , 牙龈正常牙龈正常, , 主诉该牙无既往病史。在拔牙过程中不增主诉该牙无既往病史。在拔牙过程中不增隙也不使用牙挺隙也不使用牙挺, , 拔除后拔除后, , 用消毒刮匙刮取拔牙创骨壁中部的牙周用消毒刮匙刮取拔牙创骨壁中部的牙周膜膜, , 将刮取的牙周膜立即放入盛有培养基的无菌瓶中将刮取的牙周膜立即放入盛有培养基的无菌瓶中, , 送往实验室送往实验室处理。处理。3 3）、）、 组织块的冲洗组织块的冲洗: : 在洁净工作台上用含双抗在洁净工作台上用含双抗( ( 青霉素青霉素100u/100u/ ml,ml, 链霉素链霉素100100L Lg g /
5、/ mlml ) ) 的的HANKHANK. . S S 液反复冲洗液反复冲洗3 3 次次, , 尽量去除组织块尽量去除组织块上附着的血污等其它杂质和细菌。上附着的血污等其它杂质和细菌。4）、）、PBSPBS 冲洗冲洗2 2次后次后, , 加入加入0.0. 125%125% 胰蛋白酶及胰蛋白酶及0.0. 1%1%胶原酶胶原酶5ml,5ml, 3737振荡下消化振荡下消化303060min60min。镜下观察。镜下观察, , 组织松散、大部分细胞游离组织松散、大部分细胞游离时时, , 用吸管吹打使其彻底分散。将消化的细胞悬液经用吸管吹打使其彻底分散。将消化的细胞悬液经190190目筛过滤目筛过滤
6、, , 收集并离心收集并离心( ( 10001000 r r / / min,min, 1010 min)min) , , 弃去上清液。弃去上清液。5 5）、加入含）、加入含10%10%小牛血清的小牛血清的DMEMDMEM 培养基培养基, , 充分吹打细胞悬液充分吹打细胞悬液, , 血细血细胞计数板计数胞计数板计数, ,将细胞按将细胞按4 4 105105 / / 瓶接种于瓶接种于25cm225cm2 培养瓶培养瓶, , 加入加入4 4 mlDMEMmlDMEM 培养基培养基, , 内含内含10%10%小牛血清、青霉素小牛血清、青霉素100u/100u/ mlml、链霉素、链霉素100100L
7、 Lg g / / ml,ml, 于二氧化碳孵箱内培养。培养条件为于二氧化碳孵箱内培养。培养条件为5%CO25%CO2、95%95%空气、空气、3737、饱和湿度。待细胞贴壁后、饱和湿度。待细胞贴壁后, , 隔日换液。隔日换液。4 4、注意事项：、注意事项：1 1）、在收集标本）、在收集标本, , 供体年龄越小越易取得成功供体年龄越小越易取得成功, , 标本要新鲜并及时标本要新鲜并及时处理。在刮除牙龈处理。在刮除牙龈1/1/ 3 3牙周组织以避免污染的情况下牙周组织以避免污染的情况下, , 要彻底刮下要彻底刮下中中2/2/ 3 3剩余牙周组织剩余牙周组织, , 以防止牙周膜细胞成分的丢失。以防
8、止牙周膜细胞成分的丢失。2 2）、）、 在消化时间上在消化时间上, ,应根据组织块的大小采用不同的消化时间。本应根据组织块的大小采用不同的消化时间。本实验采用实验采用0.0. 1%1%胶原酶和胶原酶和0.0. 125%125% 胰蛋白酶联合消化约胰蛋白酶联合消化约50min50min左右左右, , 显微镜下密切观察组织消化情况显微镜下密切观察组织消化情况, , 及时收集细胞及时收集细胞, , 消化时间过长消化时间过长, , 将会影响细胞贴壁及成活率。将会影响细胞贴壁及成活率。3 3）、）、 在细胞贴壁方面在细胞贴壁方面, , 通常原代细胞贴壁速度较慢通常原代细胞贴壁速度较慢, , 可通过可通过
9、:a.:a. 培养瓶胶原涂膜培养瓶胶原涂膜; ; b.b. 在培养瓶内盛有少量培养基并预先在培养瓶内盛有少量培养基并预先1 1、2 2天放置天放置二氧化碳孵箱内二氧化碳孵箱内, , 使用前吸出培养基使用前吸出培养基, , 以改善瓶壁表面性状以改善瓶壁表面性状; ; c.c. 使使用进口一次性塑料培养瓶用进口一次性塑料培养瓶( ( Nunc,Nunc, Danmark)Danmark) 等方法等方法, , 可提高牙周膜可提高牙周膜细胞成活及贴壁速度。细胞成活及贴壁速度。 静置培养静置培养, , 在原代培养最初接种在原代培养最初接种2424小时内小时内, , 细胞尚未完全贴壁或刚贴壁细胞尚未完全贴
10、壁或刚贴壁, , 不可轻易震动培养瓶不可轻易震动培养瓶, , 以防止刚贴壁以防止刚贴壁的细胞重新漂浮。的细胞重新漂浮。4 4）、由于细胞比较娇嫩）、由于细胞比较娇嫩, ,制备单细胞悬液过程中要求操作轻、稳制备单细胞悬液过程中要求操作轻、稳, ,吹吹打时忌产生气泡。另外整个制备单细胞悬液过程在冰打时忌产生气泡。另外整个制备单细胞悬液过程在冰 上进行上进行, ,能更能更好地保持细胞活力。好地保持细胞活力。5 5）、一定要注意无菌操作。）、一定要注意无菌操作。5 5、目的细胞的鉴定方法：、目的细胞的鉴定方法：1 1）、）、 细胞形态学观察细胞形态学观察倒置显微镜下牙周膜成纤维细胞呈星形、长梭形倒置显
11、微镜下牙周膜成纤维细胞呈星形、长梭形, , 胞体丰满胞体丰满, , 胞浆胞浆均匀均匀, , 核圆形或卵圆核圆形或卵圆, , 核仁清晰。核仁清晰。2 2）、）、 免疫组化染色观察免疫组化染色观察牙周膜成纤维细胞波丝蛋白染色阳性牙周膜成纤维细胞波丝蛋白染色阳性, , 细胞胞浆棕黄色着色细胞胞浆棕黄色着色, , 角蛋角蛋白染色阴性白染色阴性, , 证实该细胞为中胚层来源。证实该细胞为中胚层来源。6、困难及解决办法：、困难及解决办法： 1）、）、 刮离牙周组织要彻底，操作过程中动作轻柔。刮离牙周组织要彻底，操作过程中动作轻柔。 2）、在实验准备阶段器清洗器械时要细致认真。若忽略培养瓶内的）、在实验准备阶段器清洗器械时要细致认真。若忽略培养瓶内的细小的杂质，可导致在培养过程中一些杂质也在瓶内生长细小的杂质，可导致在培养过程中一些杂质也在瓶内生长 。3）、自身专业技能不熟练，吹打是过多气泡产生，无菌观念不强等）、自身专业技能不熟练，吹打是过多气泡产生，无菌观念不强等原因，在培养过程中导致细胞死亡。原因，在培养过程中导致细胞死亡。
