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1、坛紫菜坛紫菜(Pyropia haitanensis)核糖体基因簇序列的测定核糖体基因簇序列的测定 张皓 何渊 沈颂东 苏州大学医学部基础医学与生物科学学院 邮编：215123 作者简介：张皓（1985-） ，男，江苏太仓人，硕士，主要研究方向为基层医学与养殖 E- mail：richard 何渊（1990-） ，男，江苏太仓人，硕士，主要从事藻类细胞发育与分子机理研究。E- mail：。 通信作者：沈颂东（1968-） ，男，博士，教授，主要从事藻类细胞发育与分子机理研究。 E-mail： 摘要摘要：坛紫菜是我国独有的栽培紫菜物种，而目前对坛紫菜分类学层面上仍缺乏有效的分 子鉴定技术。本研
2、究通过 PCR 方法，对采自福建省莆田海区坛紫菜样品核糖体基因簇序列 进行了测定，目的是为坛紫菜分类及种质鉴定提供分子生物学证据。测定结果表明，坛紫 菜样品的 18S rDNA 的全长序列长度为 2953bp；28S rDNA 部分序列 3603bp，且不含内含 子；5.8S rDNA 长度为 158bp，该区域的 5端和 3端十分保守，在紫菜属中差异较小； ITS1 的长度为 334bp；ITS2 为 678bp。已经测定 IGS 区的部分长度为 3555bp，该区域存在 复杂二级结构。通过对坛紫菜核糖体基因簇序列的分析表明，其能够成为紫菜分类鉴定与 系统演化的分子标记。 关键词关键词：坛紫
3、菜；核糖体；顺反子；系统演化The nuclear ribosomal DNA (nrDNA) cistron sequence of Pyropia haitanensis (Bangiales, Rhodophyta)Hao Zhang, Yuan He, Songdong ShenSchool of Biology and Basic Medical Sciences, Soochow University, Suzhou 215123, ChinaAbstract: Pyropia haitanensis is a unique cultivated laver in China, w
4、hile the lack of effective molecular idenfitication technology affects the taxonomy of P. haitanensis. The study sequenced the nuclear ribosomal DNA (nrDNA) cistron sequence of P. haitanensis from Putian, Fujiang Province by polymerase chain reaction (PCR), in order to provide molecular biological e
5、vidience for classification and germplasm identification of P. haitanensis. Results shown that each unit is composed of the small-subunit (SSU) rRNA gene of which the full length is 2953bp; the partial sequence of the large-subunit (LSU) rRNA gene of which the length is 3603bp without any introns; t
6、he length of the 5.8S rRNA gene is 158bp, the 5 and 3 terminal sequences of the genic regions of the ribosomal cistron are extremely conservative among genus of Pyropia; the length of ITS1 is 334bp and ITS2 is 678bp; the partial sequence of IGS is 3555bp, due to a complicated secondary structure exs
7、its in IGS region makes sequencing untoward. Though the analysis of nuclear ribosomal DNA sequence, it can be a molecular maker for the taxonomic identification of Pyropia.Keywords Pyropia haitanensis; ribosome; cistron; system evolution引言引言 紫菜广泛分布于世界各地，自然生长的紫菜数量十分有限，因此目前用作食用以及研 究的紫菜主要是通过人工养殖，我国紫菜产量
8、居世界首位，紫菜已成为重要的经济海藻之 一1。坛紫菜(Pyropia haitanensis)隶属于红藻门(Rhodophyphyta)，原红藻纲 （Protoflorideophyceae） ，红毛菜目(Bangiales)，红毛菜科（Bangiaceae） ，紫菜属(Pyropia)， 原产于福建的平潭、莆田、惠安等地，系暖温性海藻，是我国特有的也是主要的栽培品种 之一，其产量约占全国紫菜产量的 75%，是具有重要经济价值的红藻2。 坛紫菜生物学特征类似于红藻门中的其他紫菜，具有异形世代交替的生活史，包括大 型的叶状体和小型的丝状体两个阶段，叶状体阶段是作为食用的阶段，而对于种质保存则 以
9、丝状体阶段为主3。对叶状体的形态学描述通常作为区分不同紫菜属的经典分类方式， 实际分类中，研究者更倾向于根据地理位置和其他的一些环境条件来进行区分，因此缺乏 一些稳定的分类特性是区分紫菜属的一个巨大障碍4。随着基础研究的加强，坛紫菜的育 种及栽培技术得到了显著提高，但其种质资源的研究暴露出了很大问题，缺乏科学有效的 种质鉴定技术严重影响了坛紫菜的良种选育和广泛推广，因此开发一些有效的种质鉴定技 术变得非常重要5。近年来，分子生物学技术得到了快速发展，越来越多的研究倾向于采 用分子生物学方法结合传统细胞生物学等方法来对紫菜属进行分类，这使得分类鉴定工作 变得更为精确和高效。 在海藻的分子生物学层
10、面的分类研究中，核糖体 DNA 被越来越多的关注6-8。核糖体 RNA 基因（rDNA）是植物界最保守的基因之一9，由高度串联的重复序列构成，且拥有 转录活性的多基因家族，它以成簇的方式储存在一条或者多条染色体的核仁区。真核生物 的 rRNA 包括基因内间隔区（IGS） ，18S rDNA(SSU)，内转录间隔区 1（ITS1） ，5.8S rDNA， 内转录间隔区 2（ITS2）和 28S rDNA(LSU)，其中 18S rDNA、5.8S rDNA 和 28S rDNA 顺序串联，构成了一个转录单位，又称顺反子（cistron） 。18S、5.8S、28S 被两个内 转录间隔区（ITS）
11、1 和 2 分隔开来。而转录单位之间又被基因内间隔区（IGS）分隔开， IGS 则包含一个非转录间隔区（NTS）以及一个外转录间隔区（ETS） 。核仁区有很多这样 的串联重复单元，这些重复单元的进化趋于同步，可称之为协同进化，从而使转录单元在 同一种群间保持同质性10-11。然而同一重复单元的不同区域由于具有不同的功能，导致进 化速率存在差异，研究人员运用进化速率较慢相对来说较为保守的 18s rDNA 和 28s rDNA 作为区分紫菜种上的分子标记12，而进化速率略快的 ITS 区则结合 5.8s rDNA 用来对紫菜 种间进行区分13-14，IGS 区则是高度可变区，是一种较为灵敏的分子
12、标记，已经应用于紫 菜种下的分类鉴定工作中15-16。 本文选取福建莆田的坛紫菜作为实验材料，测定其核糖体 RNA 基因，得到了大部分 的基因簇序列，为紫菜属的系统进化、分类鉴定提供有价值的信息，另外本文获取坛紫菜 核糖体基因簇序列的方法也可为今后获取其他红藻的序列提供重要的参考信息。图 1. 核糖体 DNA 重复单元的基本结构图 Figure 1. Schematic diagram of the tandem repeated ribosomal DNA1 材料与方法 1.1 实验材料 本实验使用坛紫菜叶状体于 2012 年采自福建莆田栽培海区筏架，阴干后，放置于-20 保存。 1.2 研
13、究方法 1.2.1 DNA 提取 将样品放入消毒海水中复苏，挑取健康完整叶状体，超纯水清洗3次，吸水纸吸去藻体 表面水分。将混合的叶状体和单个的叶状体叶片分别置于研钵中，经液氮充分研磨成粉末 状。采用CTAB法17进行DNA的提取:加入适量60水浴的CTAB裂解提取液，充分混匀。 将600L混匀的液体分别转移到1.5ml的Eppendorf 管中，60温浴3个小时。取出样品，分 别向每管中加入1/3体积的5mol/L 醋酸钾，和样品等体积的氯仿：异戊醇（24:1），振荡充 分混匀，至溶液无分层现象。8000rpm，离心15min，将上清液移至新管，加入2/3体积的异 丙醇，上下混匀，13000
14、rpm，4，离心20min，沉淀DNA。用70%的乙醇清洗沉淀1-2次， 沉淀在无菌风下吹干后溶于400L 1TE缓冲液中。沉淀完全溶解后，重复氯仿：异戊醇 （24:1）的抽提步骤。在上清液中加入两倍体积的无水乙醇，上下混匀，13000rpm，4， 离心20min，沉淀DNA。沉淀在无菌风下吹干后溶于50L 0.1TE缓冲液中备用。用1%的琼 脂糖凝胶电泳检测DNA质量。1.2.2 引物的设计及 PCR扩增各个区段的引物序列及位置如表 1 所示。由于 IGS 有复杂结构，因此设计了多对 引物进行扩增。 利用提取的福建莆田坛紫菜 DNA 作为模板，所用 50L 的 PCR 反应体系中含有 5L
15、模板 DNA，5L dNTP Mixture（2.5mmol/L each） ，上下游引物（20mol/L）各 1L，5L 10LA PCR Buffer（Mg2+plus） ，0.3L Taq（5U/L） ，32.7L ddH2O。PCR 条件如表 2。表 1：PCR 的引物Table 1: Primers used for PCRRegionPrimersSequence（5-3）Source of primerSSUFCAACCTGGTTGATCCTGCCAGT18S: 1-22 (GenBank No. AB013177)SSU SSURAATGATCCTTCCGCAGGTTCAC18
16、S: 2328-2349 (GenBank No. AB013177)LSUFCCATAACGCATCAGGTCC28S: 1937-1954 (GenBank No.JQ236860)LSU LSURCGTCAATGAGGCGAGAAAIGS: 1505-1522ITS1FTCGCTCCTACCGATTGAATG李艳燕（2010） ITS ITS1RCTCCTATTAGCGGGCACT李艳燕（2010）ITS2FTCGCAACGATGAAGAACG李艳燕（2010）ITS2RTAAGTTCAGCGGGTGGTC李艳燕（2010）IGS1FTGCTGGAATGGACGATAA李艳燕（2010）IGS1RAGCCATTCGCAGTTTCAC李艳燕（2010）IGS2FCTTCTGGATGCGGGACGAGTA A28S: 1895-1916 (Gen
