专业实验：专业实验： 纤维素酶的固态发酵及酶活力的测定纤维素酶的固态发酵及酶活力的测定一、实验目的：一、实验目的：1.学习固态发酵生产纤维素酶的方法；2.掌握纤维素酶测定的方法；3.了解不同条件对纤维素酶活力的影响二、实验原理二、实验原理纤维素是地球上含量最丰富的有机化合物据不完全统计，全球每年通过光合作用产生的纤维素最高达 1. 7 亿 t其中大部分尚未被合理利用目前，我国约有一半以上的农作物秸秆在田间地头被白白烧掉可见，利用纤维素酶水解农作物秸秆等废弃物，使其转化为酒精、粮食和化学制品，具有巨大的经济价值和现实意义纤维素酶能将天然纤维素降解，生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖，然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下，另一方面，纤维素酶多是采用纯的纤维素粉、无机盐等配制而成的培养基进行液态发酵，对培养基要求高，酶系不全且易造成环境污染等问题，在实际进行大规模生产纤维素酶中还有较多困难利用廉价的原料，采用固态发酵技术，可望有助于进一步降低纤维素酶的生产成本三、实验材料和仪器三、实验材料和仪器1、材料： 麸皮（麸皮粉碎，过1 mm筛） ；滤纸；产纤维素霉菌种；酒精（95％） ；浓硫酸；蛋白胨；羧甲基纤维素钠；NH4NO3；酵母膏；刚果红；3，5-二硝基水杨酸，乙酸等。
1）菌种保藏培养基，PDA琼脂2）种子培养基，麸皮2％，(NH4)2SO4 0.2％，蛋白胨0.1％，KH2PO 0.1％ ，CaCO30.1%，自然pH，50 mL三角瓶装培养基5 mL，121℃ 灭菌，30 m in3）发酵培养基:纤维素材料90％，麸皮10％，(NH4)2SO4 2.5％，蛋白胨0.5％，水250 mL，250 mL三角瓶装干料10g，121℃灭菌20 min4）0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8） 溶液A：量取冰醋酸6mL，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液 溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000mL，制成0.1M醋酸钠溶液 使用时以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用5）DNS显色剂称取酒石酸钾钠182.0g，溶于500mL蒸馏水中，加热（不超过50℃） ，于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，NaOH 21.0g，加热搅拌，使之溶解，再加入苯酚5.0g，无水亚硫酸钠5.0g，搅拌至溶解完全，冷却后用蒸馏水定容至1000mL贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用6） CMC（1%） 准确称取1.000g羧甲基纤维素钠，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100mL。
7） 葡萄糖标准溶液（1.0mg/mL）：称取1.000g葡萄糖（AR）(105℃干燥至恒重)用蒸馏水溶解后定容至1000mL，冰箱保存备用8） 滤纸条：1cm×6cm 新华滤纸2、仪器：生化培养箱；水浴锅；天平；分光光度计；接种环；试管；三角瓶；比色管四、实验方法和步骤四、实验方法和步骤1、斜面培养、斜面培养纤维素酶生产菌种接入斜面培养基中，在一定 30℃下培养 5～6d，观察和记录纤维素酶生产菌生长的典型现象斜面孢子液的制备斜面孢子液的制备吸取 5mL 蒸馏水于斜面试管中，接种环刮洗孢子，计数锥形瓶固态发酵锥形瓶固态发酵接种 5mL 孢子悬浮液（107～108个/mL）于装有固体产酶培养基中，置于生化培养箱中，以待测的温度和时间进行培养考察不同因素对酶活的影响发酵结束后置于 45℃烘箱中干燥过夜4、酶活力的测定、酶活力的测定（1）粗酶液的制备称取 1g 干燥固态发酵曲，加入 10 倍的 0.1mol/L pH4.8 的乙酸缓冲液，室温下浸泡 4h，于 4000r/min 离心 15min，取上清液测定酶活2）酶活的测定①标准曲线的绘制（根据实际测定的酶液吸光值，对应该曲线可以查出相应的酶活力）分别吸取 1mg/mL 标准葡萄溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL，分别定容至50mL。
再分别吸取上述溶液各 1.5mL 于比色管中，各加 1.5mL3,5 一二硝基水杨酸溶液，煮沸 5min（另作 1 管对照，取 1.5mL 蒸馏水，加 1.5mL3,5 一二硝基水杨酸溶液，同样煮沸 5min冷却后，用分光光度计在 540nm 波长下比色，以光密度做纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫摩尔数（酶活力）为横坐标，绘制标准曲线②羧甲基纤维素酶活（CMCase）测定取 1mL 酶液（稀释 10 倍） （另取 1mL 酶液在沸水浴中煮 20min 灭活对照） ，加入 1mL pH=4.8 的 1%CMC-Na 溶液，置于 50℃中恒温反应 30min，然后加入1mL DNS，在沸水浴中显色 5min，冷却，定容至 25mL，摇匀，测 540nm 吸光度（以灭活的的酶液经同样操作后作为对照） ③ 滤纸酶活的测定取 1mL 酶液（稀释 10 倍）加 1mL0.1mol/L pH4.8 的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入 1 条 1cm×6cm 新华滤纸（约 50mg） ，50℃保温 1h，取出，加入1mL DNS，在沸水浴中显色 5min，冷却，定容至 25mL，摇匀，测 540nm 吸光度（以灭活的的酶液经同样操作后作为对照） 。
在上述条件下，1h 内由底物生产 1μmol 葡萄糖所需的酶量定义为 1 个酶活力单位（U） 酶活计算公式：酶活力（U/g）＝葡萄糖含量（mg）×酶液定容总体积（mL）×5.56/[反应液中酶液加入量（mL）×样品重（g）×时间（h）]式中，5.56 为 1mg 葡萄糖量底物物质的量（μmol） 5、各种因素对产酶的影响、各种因素对产酶的影响（1）不同碳源对产酶的影响碳源羧甲基纤维素酶活（CMCase）(U/g)滤纸酶活（FPAU）(U/g)杂草（加麸皮）杂草（不加麸皮）竹屑滤纸（2）不同氮源对产酶的影响氮源羧甲基纤维素酶活（CMCase）(U/g)滤纸酶活（FPAU）(U/g)(NH4)2SO4 0.5％蛋白胨 2％尿素 0.5％酵母膏 0.5％（3）不同装瓶量对产酶影响装瓶量羧甲基纤维素酶活（CMCase）(U/g)滤纸酶活（FPAU）(U/g)5g10g15g30g（4）不同接种量对产酶影响接种量羧甲基纤维素酶活（CMCase）(U/g)滤纸酶活（FPAU）(U/g)0.512.55（5）不同初始 pH 对产酶的影响培养基原始 pH羧甲基纤维素酶活（CMCase）(U/g)滤纸酶活（FPAU）(U/g)3.54.55.56.5（6）不同培养温度对产酶的影响不同培养温度（℃）羧甲基纤维素酶活（CMCase）(U/g)滤纸酶活（FPAU）(U/g)253035405、、实验结果实验结果1、写出固态发酵生产纤维素酶的主要步骤。
2、计算发酵所得纤维素酶的酶活3、根据实验结果对影响纤维素酶生产的主要条件进行分析，得出结论6、、思考题思考题1、固体发酵生产纤维素酶有哪些优势？2、请查阅相关资料，阐述纤维素酶是如何作用于纤维素的？3、请查阅相关资料，阐述纤维素酶酶活力测定的原理。