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1、浙江大学博士学位论文低浓度烷化剂诱发的细胞应答反应的蛋白质组学研究姓名：金静华申请学位级别：博士专业：生理学（病理生理学）指导教师：余应年2003.4.1浙江大学博士学位论文金静华缩略语( A b b r e v i a t i o n s )A P1 ：a c t i v a t e dp r o t e i nl3 N K ：c - J u nN H 2 一t e r m i n a lk i n a s eB S A ：b o v i n es e r u ma l b u m i nM A P K ：M i t o g e nA c t i v a t e dP r o t e i n
2、K i n a s eB P D E ：b e n z o a p y r e n ed i o le p o x i d eM M S ：M e t h y lm e t h a n e s u l f o n a t eC C A ：a - c y a n o - 4 - h y d r o x y c i n n a m i ca c i dM N N G ：C H A P S ：3 - 【( 3 一c h o l a m i d o p r o p y l )N o m e t h y l - N - n i t m - N - n i t r o s o g u a n i d i
3、n ed i m e t h y l a m m o n i o 一1 - p r o p a n eM O P S ：3 - ( N - m o r p h o l i n o ) e t h a n e s u l f o n i ea c i ds u l p h o n a t eN F r B ：n u c l e a rf a c t o rk a p p aBC T C F ：C C C T C b i n d i n gf a c t o rP A G E ：p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i
4、sC R E B ：C R Eb i n d i n gp r o t e i nP B S ：p h o s p h a t e - b u f f e r e ds a l i n eD E P C ：D i e t h y lp y r o c a r b o n a t eP I K K ：p h o s p h o i n o s i t i d ek i n a s er e l m e dk i n a s eD M S O ：D i m e t h y lS u l f o x i d eP K A ：p r o t e i nk i n a s eAd N T P s ：D
5、e o x y r i b o n u c l e o s i d eT r i p h o s p h a t e sP M S F ：p h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d eD T T ：D i t h i o t h u r e i t o lP T P H I ：p m t e i n - t y r o s i n ep h o s p h a t a s eE B ：E t h i d i u mB r o m i d eS D S ：S o d i u mD o d e c y lS u l f a t eE D
6、 T A ：D i s o d i u mT A E ：T r i s - a c e t a t e E D T Ae l e c t r o p h o r e s i sE t h y l e n e d i a m i n e t e t r a - a c e t a t eb u f f e rE R K ：E x t r a c e l l u l a rs i g n a l - r e g u l a t e dk i n a s eT E M E D ：t e t r a e t h y le t h y l e n e d i a m i n eH E P E S ：T
7、F A ：t r i f l u o r o a c e t i ca c i dN - 2 h y d r o x y e t h y i p i p e r a z i n e - N - 2 e t h a n e s u l f oT P A ：1 2 - O - t e t r a d e c a n o y lp h o r b o l - 1 3 - a c e t a t en i ca c i dT P C K ：N * - T o s y l - P h eC h l o r o m e t h y lK e t o n eI P G ：i m m o b i l i z
8、e dp Hg r a d i e n tU V ：u l t r a v i o l e t浙江大学博士学位论文金静华低浓度烷化剂诱发的细胞应答反应 的蛋白质组学研究浙江大学生理学博士研究生：金静华导师：余应年摘要：单功能烷化剂N 一甲基一N 1 - 硝基- N 亚硝基胍( M N N G ) 是一种在环境中广泛存在的化学诱变剂和致癌剂，它能和D N A 及蛋白质等生物大分子形成加合物( a d d u c t ) ，其引起的与突变有关的主要D N A 损伤类型是0 6 甲基鸟嘌呤，这种损伤与肿瘤尤其是胃癌的发生密切相关。但是D N A 损伤并不是引起突变的必要条件，一个典型的例子就是发生在
9、B 淋巴细胞的免疫球蛋白( I g ) 可变区基因上的“体细胞超突变( s o m a t i ch y e r m u t a t i o n ) ”，是由表面抗原受体而不是D N A 损伤驱动的主动突变。环境诱变剂引起的突变也可发生在非D N A 损伤部位，我们称之为非定标性突变( n o n t a r g e t c dm u t a g e n e s i s ) 。这种突变除了可能由D N A 损伤途径触发外，也有可能通过非核起源的外遗传( e p i g e n e t i c ) 途径，激活细胞信号转导通路，引起一系列基因表达的改变而最终导致突变的形成。同样地，环境诱变剂诱发的
10、细胞应答反应也不只是单纯地由D N A 损伤所触发的。自环境毒物接触细胞开始，细胞就发生了一系列广泛和复杂的应答反应以应对此不良环境。其中包括了即刻发生的并不依赖于核损伤信号的信号转导通路的激活和较迟发生的基因表达的改变。我们实验室曾用一特殊的突变检测系统，直接证明D N A 损伤剂可在哺乳动物细胞诱发非定标性突变：首先用低浓度( 0 2 1 t M ) 的短寿烷化剂M N N O ( 半寿期为1 1 h r ) 处理细胞2 5 h 后，继续培养2 4 h ，将重组有用作突变检测的靶基因s u p F t R N A基因的穿梭质粒p Z l 8 9 转入细胞复制，发现在未受致癌物直接攻击的穿梭
11、质粒中有较自发突变率高5 倍以上的靶基因突变。这种突变并非在接受M N N G 攻击以浙江大学博士学位论文金静华后立刻出现，而是具有时相依存性，在致癌物攻击后其发生率逐渐升高，在1 2 h达最高峰，以后逐渐下降。且突变谱明显不同于由M N N G 直接攻击引起的定标性突变，有其突变好发部位的序列特异性。进一步地，我们还证明了低浓度M N N G 的作用下有广泛的细胞反应，尤其是在信号转导通路的激活和基因表达的改变的研究中取得了一些突破性的进展。例如细胞表面受体如表皮生长因子受体、肿瘤坏死因子受体发生聚簇，细胞信号转导通路c A M P P K A C R E B 和Y N K S A P K
12、被激活。更值得注意的是这些有关信号转导通路的激活并不依赖于细胞核中的D N A 损伤，因为在除细胞核的细胞中这些细胞通路的激活仍可被诱发。我们还利用m R N A 差异显示技术分离到了近3 0 个在M N N G 处理后表达改变的表达序列标签( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g ，E S T ) 。其中9 号片段在M N N G 处理后表达增高，其表达改变不受蛋白质合成抑制剂的影响。利用反义核酸技术构建含反向插入9 号片段的真核细胞表达重组体并转染细胞，以获得反义R N A 阻断v e t o 细胞中相应基因的表达，发现M N N O 诱发的非定标性突
13、变频率显著增高，提示被阻断的相关基因的表达产物可能参与抑制非定标性突变的发生。由此可见，信号转导通路的激活和基因表达的改变可能是环境诱变剂通过非D N A 损伤途径诱发哺乳动物细胞非定标突变发生的关键所在。所以，从整体上研究烷化剂作用后细胞基因表达谱改变，对于了解化学致癌物诱发的哺乳动物细胞应激反应的全貌和揭示非定标性突变的发生机制具有非常重要的意义。虽然，利用m R N A 差异显示技术和基因芯片技术可在转录水平高通量的筛选基因表达的差异，但是这些技术都不能提供转录后的尤其是蛋白质在翻译后修饰的信息，而蛋白质通常是细胞内的功能执行者。蛋白质组学的技术一一种能同时研究成千上万种蛋白质的技术一更
14、适合于研究细胞对烷化剂的应答反应。因此，本研究中我们利用蛋白质组学的技术研究了低浓度M N N G 诱发的哺乳动物细胞蛋白质的表达差异：并且，利用双向凝胶电泳结合相应的2 D 分析软件比较了反义阻断9号片段相关基因的v e r o p M a m p “ 9 。细胞和转染空载体的对照细胞v e r o p M a m p 。在M N N G 处理后细胞蛋白质组的表达差异，为阐明9 号片段相关基因的作用机制提供线索。双向凝胶电泳方法的建立和低浓度M N N G 诱发的人羊膜F L 细胞蛋白质的浙江大学博士学位论文金静华差异表达的初步分析：F L 细胞用0 2 5 0 - M 的M N N G 处
15、理2 5 小时后继续培养1 2小时，对照组用溶剂二甲亚砜处理，然后提取细胞总蛋白，用双向凝胶电泳分离，电泳后的凝胶用银染进行染色，并用专门的计算机软件对电泳结果进行数据采集和图象分析，建立蛋白质组差异表达谱。结果：M N N G 处理后的F L 细胞中检测到l O 个新出现的蛋白点，同时有5 个蛋白点在M N N G 处理后消失；有3 0 个点在表达量上有显著变化，其中1 6 个点在M N N G 处理后表达升高，另1 4 个点则表达量降低。结论：在低浓度烷化剂攻击的F L 细胞中有一系列蛋白质表达水平的改变，提示这些发生改变的蛋白质可能参与了哺乳类细胞非定标性突变的发生。低浓度M N N G
16、 诱发的人羊膜F L 细胞差异表达蛋白的鉴定：为了能用质谱的方法鉴定h N N G 诱发的F L 细胞的差异表达蛋白，我们采用了上样量更大，分离距离更长的2 4 e m ，p H4 7 的I P G 胶条及同时可跑1 2 块胶的E t t a nD A L TI I垂直电泳系统分离了分别用M N N G 和D M S O 处理的F L 细胞总蛋白，银染的胶经数字化成像和图象分析后发现：有6 0 多个蛋白斑点在M N N G 处理后发生了显著的变化。其中有1 8 个斑点仅在M N N G 处理后的细胞中检测到，1 3 个斑点则在M N N G 处理后消失：另外有3 1 个蛋白斑点在M N N G 处理后表达量升高或降低，其中变化最大可达5 倍以上。我们进一步对胶上的差异蛋白斑点用自动凝胶采样系统进行自动的采集，然后用特异性的胰酶消化，酶解后的肽段用基质辅助的激光解吸离子化一飞行时间质谱( M A L D I - T O F ) 鉴定，得到各个蛋白的肽质指纹图谱( p e p t i d em a s sf i n g e r
