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1、培养局的纯培养培养局的纯培养实验六微生物的纯培养一、目的与要求1. 学习并掌握各种无菌操作技术，并用此技术进行微生物稀释分离、划线分离接种。2. 用平板划线法和稀释法分离微生物。3. 了解四大类微生物的培养条件和培养时间。3. 认识微生物存在的普遍性，体会无菌操作的重要性。二、实验原理纯培养技术是实验室中最基本的操作技术，由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用的接种方法不同，都是为获得良好的纯种微生物，为此，接种通常都应在空气经过消毒的“无菌室”或接种箱内进行，同时因接种方法不同，常采用不同的接种工具。微生物的分离与纯化技术的应用：分离具有特殊功能的微生物、优良菌种及纯化被污染的菌种等。纯
2、种分离技术是微生物学中重要的基本技术之一。分离：从混杂的微生物群体中获得单一菌株纯培养的方法。纯化（纯培养）：一株菌种或一个培养物中所有的细胞或孢子都是由一个细胞分裂、繁殖而产生的后代。微生物的分离与纯化常用方法有：1.简易单细胞挑取法单细胞挑取法可以直接得到纯培养。它需要特制的显微操纵器来分离单细胞，或直接在普通显微镜下利用低倍镜分离单孢子的方法。2.平板分离法 稀释分离法有倾注法和涂布法两种；菌种被其他杂菌污染时或混合菌悬液常用划线法进行纯种分离。该方法操作简便，普遍用于微生物的分离和纯化，其原理包括两方面：（1）选择适合于目标微生物生长的条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求或加入某种抑制
3、剂造成只利于该微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物。（2）微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养，可通过稀释涂布平板法、稀释混合平板法或平板划线等技术实现。但从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。还应结合菌落特征、显微镜检测个体形态特征，甚至要经过多次的分离与纯化过程和多种特征鉴定才能获得。微生物分离纯化的一般流程图如下：三、实验材料1. 所需仪器：净化工作台、微波炉、酒精灯等2. 所需耗材：各小组自行选择微生物来源，如土壤、污水等。6 套无菌培养皿、250ml 三角瓶（
4、一个装 45mL 无菌水，一个装100ml 固体培养基） 、4 支无菌 1ml 刻度吸管吸管、3 支装有 9mL 无菌水的试管、6 支装 10ml 牛肉膏蛋白胨培养基搁置斜面、记号笔、接种环、酒精灯、火柴等。灭菌的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基 100 ml。四、实验步骤1. 倒平板培养基加热溶化，待冷至 55-60后，取灭菌后的培养皿，右手持盛有培养基的三角瓶在火焰旁边，左手将瓶塞轻轻地拔出，将瓶口保持对着火焰，然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞（若培养基一次用完，瓶塞可不必夹在手中） 。左手拿培养皿，并将培养皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约 15ml，加盖后轻轻晃动培养皿，使培养基均
5、匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面，待凝固后即为平板。在无菌培养皿底部注明稀释度、组别、班级等。2. 制备稀释液（1）取表层以下 5-10cm 处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4冰箱中暂存。称取土壤 5g，放入 45mL 无菌水的三角瓶中，振荡10min，即为稀释 10-1 的土壤悬液。（2）另取装有 9mL 无菌水试管 3 支，用记号笔编上 10-2、10-3、10-4。取已稀释成 10-1 的土壤液，振荡后静止 0.5min，用无菌吸管吸取 1mL 土壤悬液加入 10-2 的无菌水试管中，并在试管内轻轻吹吸数次，使之充分混匀，即成 10-2 土壤稀释液。同法依次连续稀释至 10-3、1
6、0-4 土壤稀释液。在土壤稀释过程中，需换用不同的吸管。3. 平板分离（1）稀释涂平板法（不做）取一吸管，以无菌操作法分别吸取 10-4、10-5、10-6 土壤稀释液0.1mL，加在已制好的平板培养基上。用玻璃刮铲将稀释液在培养机上充分混匀铺平，倒置于恒温箱培养。（2）稀释混合平板法（混菌法）取一吸管，以无菌操作法吸取 10-3、10-4 土壤稀释液 1mL，加在空培养皿中，再倒入适量 1520ml 冷却好的培养基，水平轻轻转动培养皿，使菌液、培养基充分混匀铺平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒温培养箱培养，用于稀释混合平板法分离及平板菌落计数实验。（3）稀释平板划线法用接种环取相应的菌液（
7、10-2）一环在平板上划线。a.连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基表面作连续划线。b.分区划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤稀释液 1 环，先在培养基的一边作第一次平行划线 34 条，再转动培养皿约 60。角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次划线，同法依次作第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，倒置于温室培养。4. 培养平板倒置于 37培养箱，培养 48h。挑取单个菌落接种于斜面培养基上，经多次的分离与纯化过程和多种特征鉴定最后得到纯培养。 细菌培养 37，1-2d；放线菌培养 28，5-7d；霉菌培养 28，3-5d。5. 镜检斜面培养物（革兰氏染色）
8、，并绘图，清洗所有的玻璃器皿。要求：每组至少分离出两种细菌及微生物，并能简要描绘其菌落形态及显微镜下的形态。五、实验结果观察描述菌落形态，并绘图。六、思考题1. 如何确定平板上某个单菌落是否为纯培养？请写出实验的具体步骤。2. 当平板上长出的菌落不是均匀分散，而是集中在一起时，你认为问题出在哪里？3. 平板培养时为什么要把培养皿倒置？4. 在划线分离时，为什么每次都需要将接种环上的剩余物烧掉？附：常见的微生物接种方法接种细菌应用接种针（环）来沾取细菌标本，进行接种。接种环与接种针为用白金丝或合金丝所制，亦可用电炉丝代替，因它能耐高热且散热快，便于接种前后通过火焰灭菌（整个接种环烧红即达到灭菌目
9、的） 。在使用接种环时一般用右手持笔式较为方便，左手可持培养基进行配合，其接种程序可分为：灭菌接种环稍冷沾取细菌样品进行接种（包括：启盖或塞、接种划线、加盖或塞）进行接种环灭菌等五个程序。不同培养基，接种方法也不同，常用的几种微生物接种方法分述如下：1. 平板划线接种法（分离培养法）是将细菌分离培养的常用技术，其目的是将混有多种细菌的培养物，或标本中不同的细菌（病原菌与非病原菌）使其分散生长，形成单个菌落或分离出单一菌株，便于识别鉴定。平板划线接种方法较多，其中以分段划线法与曲线划线法较为常用。（1）分段划线法平板分段划线(左)及培养后菌落分布图本法多用于含菌量较多的标本。方法是以接种环沾取少
10、许样品先涂布于平板培养基表面一角作为第一段划线（划线时接种环与培养基表面呈 45 度角） ，然后将接种环置火焰上灭菌，俟冷（可接触平板试之，如不融化琼脂，即已冷却） ，于第二段处再作划线，且在开始划线时与第一段的划线相交接数次，以后划线不必再相接，待第二段划完时，再如上法灭菌，接种划线，依次划至最后一段，灭菌接种环。这样每一段划线内的细菌数逐渐减少，即以获得单个菌落，划线接种完毕，盖好平皿盖，倒置（平板底部向上）于 37温箱中培养。（2）连续划线法：此法多用于接种材料中含菌数量不太多的样品或培养物。方法是先将样品或培养物涂于平板表面的一角，然后用接种环自样品涂擦处开始，向左右两侧划开并逐渐向下
11、移动，连续划成若干条分散的平等线。2. 斜面接种法 此法主要用于移种纯菌，使其增殖后用于鉴定或保存菌种。通常是从平板培养物上挑取某一单独菌落或者从一支已长好的斜面菌种，移种至斜面培养基上，接种步骤如下（以从已长好的斜面菌种转接为例）：（1）左手拿两支试管，一支为经灭菌的斜面，另一支为已长好的菌种。右手持接种环或接种针通过火焰灭菌后俟冷，并同时以右手小指和无名指轻轻拔取两支试管的棉塞或试管帽（先转动棉塞后拔去） ，夹持于手指间。（2）将试管口通过火焰数次，并稍转动，以防止外界的污染。（3）首先将接种环伸入有菌试管，使接种环接触菌苔取少量菌，取出接种环，立即将管口通过火焰灭菌后将接种环伸入斜面管内
12、，先从斜面底部到顶端拖一条接种线，再自下而上的蜿蜒涂布，或直接自斜面底部向上蜿蜒涂布。此步注意接种环不可碰试管壁和接种时不要划破培养基。（4）烧试管口，塞好棉塞或盖好试管帽，将接种环插到酒精瓶中。3. 倾注培养法本法用于细菌、霉菌的计数。方法是取原始样品或经适当稀释的（通常是 10-110-5 稀释）液体 1mL，置于直径 9cm 无菌平皿内，倾入已融化并冷至 50左右的培养基约 1315mL ，立即混匀，待凝固后倒置，于一定温度下培养一定小时，作菌落计数。4. 穿刺接种法此法多用于双糖、半固体、明胶等培养基的接种，方法与斜面接种类似。用接种针挑取菌落或菌液少许，由培养基表面中央直刺至管底（若为三糖铁并在斜面加以涂布） ，然后沿穿刺线拔出接种针（注：接种半固体看动力者不穿刺到底） 。穿刺接种 琼脂固体穿刺生长形状5. 液体接种法此法多用于单糖发酵试验等，接种方法与斜面接种方法基本相同。以左手持培养基与菌种管，右手持接种环和拔持棉塞，将挑取的菌落或菌液接种于液体培养基内。
