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1、发酵法产琥珀酸发酵法产琥珀酸琥珀酸,学名丁二酸,广泛存在于动植物和微生物体内,是生物进行TCA循环的中间产物之一。它是一种重要的有机合成中间体,主要应用于食品、医药、生物降解塑料、表面活性剂、洗涤剂、绿色溶剂和动植物生长刺激物等领域。人们主要是利用化学合成的方法,从丁烷通过顺式丁烯二酐生产琥珀酸。该方法以石油为原料,生产成本高,环境污染严重,从而限制了琥珀酸的广泛应用。因此,人们开始将目标转向通过生物发酵法来生产琥珀酸。微生物发酵生产琥珀酸以可再生资源糖和二氧化碳等作为主要原料,不仅摆脱了对石油化工原料的依赖,而且可以固定二氧化碳,减少温室气体,绿色环保,具有一定的环境效益。在众多的琥珀酸生产
2、菌中，目前研究最多的是琥珀酸放线杆菌( Actinobacillus succinogenes ) , 产琥珀酸曼氏杆菌(Mannheimia succiniciproducens) , 产琥珀酸厌氧螺(Anaerobiospirillum succiniciproducens) 和大肠杆菌( Escherichia coli)等。产琥珀酸厌氧螺菌可自然产生高浓度琥珀酸, 但对高浓度葡萄糖和琥珀酸盐耐受性较差,而且要求严格厌氧环境,营养条件复杂,产物分离困难,生产成本较高,代谢途径尚未完全清楚,并且具有引起人类菌血症的潜在病毒性。产琥珀酸放线杆菌和产琥珀酸曼氏杆菌都属于瘤胃细菌,与其它测序基因
3、组相比,二者的基因组序列更为相似,有很多共同的代谢特征:如能利用葡萄糖、果糖、木糖等多种碳源;以甲酸、乙酸和琥珀酸为主要发酵产物。产琥珀酸放线杆菌能耐受高浓度的琥珀酸盐和葡萄糖,是最具发展前景的琥珀酸生产菌之一,其突变株系130Z的琥珀酸产量可达110g/L,是迄今报道的琥珀酸产量最高的菌株。但产琥珀酸放线杆菌对营养条件要求较高,并且只能在高CO2 浓度的条件下才以琥珀酸为主要产物,这需要额外的供气设备,增加生产成本。产琥珀酸曼氏杆菌虽然能以琥珀酸为主要发酵产物,但其琥珀酸产量和得率都相对较低,遗传学研究工具发展不成熟,有待于进一步提高。谷氨酸棒杆菌是工业谷氨酸生产菌,有望以纤维素糖为原料发酵
4、生产琥珀酸,而且具有成熟的遗传学研究工具和丰富的背景知识,但对其产琥珀酸的研究起步较晚,一些有机酸产生途径尚未了解清楚,琥珀酸浓度和生产率都相对较低,产物分离纯化过程复杂,成本高。大肠杆菌是模式生物,可以产生微量的琥珀酸,但是培养条件相对简单,基因组序列已完全公布,遗传背景和代谢途径比较清楚,菌种筛选和代谢途径改造比较容易,是研究琥珀酸代谢途径和提高琥珀酸产量的理想微生物。产琥珀酸厌氧螺菌研究进展产琥珀酸厌氧螺菌研究进展产琥珀酸厌氧螺菌是一种革兰氏阴性严格厌氧菌，以葡萄糖、乳糖为碳源发酵主产物为琥珀酸和乙酸，同时生成少量的甲酸、乙醇、乳酸。产琥珀酸厌氧螺菌是通过EMP途径生成磷酸烯醇式丙酮酸（
5、PEP） ，再通过羧化途径最终生成琥珀酸。CO2浓度可以调节PEP羧化激酶的表达，CO2浓度上升，胞内PEP羧化激酶浓度上升CO2对琥珀酸发酵的影响与发酵液pH有关，通入H2有利于琥珀酸的生成，对其它副产物生成没有影响。产琥珀酸所用的CO2可以由Na2CO3(浓度1.5 M)提供，此时通入CO2对产琥珀酸有负作用，对副产物乙酸的产生没有影响。产琥珀酸放线杆菌研究进展产琥珀酸放线杆菌研究进展产琥珀酸放线杆菌是一种革兰氏阴性兼性厌氧瘤胃细菌。产琥珀酸放线杆菌可以利用多种碳源，并且可以在高浓度的琥珀酸条件下生长。产琥珀酸放线杆菌与产琥珀酸厌氧螺菌的琥珀酸发酵代谢途经相同，是通过EMP途径生成磷酸烯醇
6、式丙酮酸（PEP） ，再通过羧化途径最终生成琥珀酸。密西根生物技术研究中心（MBI）的Guettler等人以Actinobacillus succinogenes130Z为出发菌株，筛选得到的自发突变株的琥珀酸产量可以达到80 g/LGuettler等人对筛选得到的自发突变株的发酵条件做了初步的研究，实验结果表明，该菌株可在高浓度的葡萄糖培养基中生长（150 g/L） ，酵母抽提物、玉米浆有利于菌体生长和产酸，O2对菌体无毒害作用，在空气中提高CO2分压有利于菌体生长和产酸，菌体的最适生长和产酸pH为6.8。产琥珀酸大肠杆菌研究进展产琥珀酸大肠杆菌研究进展厌氧条件下,大肠杆菌以糖或其衍生物为底
7、物进行混合酸发酵,发酵产物为甲酸、乙酸、乙醇、乳酸和琥珀酸等,其中琥珀酸得率较低,一般低于0. 2mol /mol葡萄糖。大肠杆菌有两种葡萄糖消耗方式,一是葡萄糖经磷酸转移酶系统( PTS)转移和磷酸化,以磷酸烯醇式丙酮酸( PEP)为辅助底物, 1 mol葡萄糖转化生成1 mol PEP和1 mol丙酮酸;二是葡萄糖借助半乳糖协同运输系统的半乳糖渗透酶到达细胞体内,经葡萄糖激酶磷酸化进入糖酵解途径, 1 mol葡萄糖最终转化为2 mol PEP。PEP可以被PEP羧化酶和丙酮酸激酶利用, PEP羧化酶催化PEP固定CO2 ,生成草酰乙酸进入C4途径,继而被后续的苹果酸脱氢酶、富马酸酶和富马酸
8、还原酶转化为琥珀酸。产琥珀酸曼氏杆菌研究进展产琥珀酸曼氏杆菌研究进展产琥珀酸曼氏杆菌是兼性厌氧革兰式阴性菌，在pH6.0-7.5时生长良好。厌氧发酵生产琥珀酸、乙酸、甲酸的比例为2:1:1。Lee等对此菌种的PEP羧激酶进行了克隆、测序和特性研究，并且在2004年对此菌株进行了全集应组测序以及基因组规模的代谢通量分析和代谢特点研究。研究结果表明，此菌株非常适合CO2环境，以富马酸作为电子受体代谢，非常利于高产琥珀酸。代谢工程改造代谢工程改造虽然大肠杆菌的琥珀酸产量不高，通常为12 mol/100 mol葡萄糖。但大肠杆菌作为典型革兰氏阴性细菌，它的基因组和蛋白质组的信息比较全，其代谢途径也比较
9、清楚，用基因重组以及其他分子生物学手段来提高它的琥珀酸产量是可行的。目前对大肠杆菌的改造研究可以归纳为如下结果：1、以野生型大肠杆菌W1485为出发菌株Clark等人通过插入外源基因使编码丙酮酸甲酸裂解酶pfl和乳酸脱氢酶ldh的基因失活的方法构建了菌株NZN111，其基因型为NZN111(F-Apfl:Cam ldhA:Kan)。NZN111不能以葡萄糖为碳源发酵生长，但可以以乳糖，果糖，甘露糖和海藻糖等为碳源发酵生成琥珀酸，乙酸和乙醇。这时底物的氧化还原水平就是决定产物生成比例的关键。对NZN111在含有卡那霉素的琼脂平板上培养并筛选到了自发突变株AFP111。AFP111能够发酵葡萄糖产
10、生琥珀酸、乙酸和乙醇，并且能够利用外源氢为还原剂。通过对AFP111的进一步研究发现其自发突变位置在编码PTS转移酶的基因ptsG，此突变导致关键蛋白酶IICBglc的合成受损。而且对于许多大肠杆菌和产乳酸杆菌的ptsG基因突变后都能够导致琥珀酸的产量上升。在AFP111发酵过程中还发现1 mol的葡萄糖似乎被发酵成为1 mol的琥珀酸和各0.5 mol的乙酸和乙醇。Vemuri等人进一步将编码丙酮酸羧化酶基因的质粒转移到AFP111中，通过IPTG诱导后，导致了琥珀酸产量的进一步提高。在两步法培养（即先有氧培养，然后无氧发酵产酸）中转换时间的选择对其产酸具有决定作用。在最适的转换条件下（即溶
11、氧浓度开始下降，但仍为90%时）琥珀酸的最终浓度可达到99.2 g/L，产率为110%，生产效率1.3g/L.h。2、Pan等人以大肠杆菌W3110作为受体菌株，构建了乙酸和乳酸形成缺陷的双重突变株SS373（W3110 pta:Tn10 ldhA:Km） 。当使用非PTS糖类发酵时，可以发酵产生几乎纯的琥珀酸。3、Millard等人通过在大肠杆菌JCL1208中过量表达PEP羧化酶，可以使琥珀酸产量提高3.5倍，但过量表达PEP激酶却没有任何效果Gorkan等人通过在大肠杆菌中表达丙酮酸羧化酶基因而得到E.coli。发现pyc的表达不影响糖的消耗速率和细胞的生长速率。在无氧条件下，pyc的表
12、达使琥珀酸的产量提高了2.7倍，同时乳酸的得率明显下降。目前产量目前产量目前世界生产琥珀酸主要采用合成法，其起始原料为顺丁烯二酸酐。据市场研究报告称，中国的化学路径生产琥珀酸已经较为成熟，但生物路径生产则还在研究阶段。国外的生物路径生产走在了中国的前面。日本三井物产株式会社首创以玉米淀粉为起始原料、酶法生产琥珀酸新工艺，其年产据称在5000吨左右。美国应用碳化学公司在2002年采用微生物发酵法生产琥珀酸，目前年产量也有5000吨。据了解，发酵法或酶法生产琥珀酸的成本大约在每吨2200美元左右，比合成法略低一点。美国拥有世界最大的玉米产量，美国应用碳化学公司利用其丰富的玉米淀粉资源经微生物发酵制
13、取琥珀酸可大大提高其玉米的产品附加值。公司拟在近期内将发酵法生产琥珀酸的年产能力扩大至7万8万吨。这样一来，琥珀酸最终成本可降至每吨500美元，即每公斤成本仅50美分。而且，发酵法生产琥珀酸的三废排放量远远少于合成法的排放量，从长远来看，如果发酵法生产琥珀酸收得率能提高2030，则今后世界各国都将放弃合成法生产琥珀酸旧工艺而改用发酵法新工艺。我国虽有多家科研机构在研究微生物发酵法生产琥珀酸新工艺，但迄今只有清华大学一家获得成功。据了解，吉林省拟利用该省丰富的玉米资源并引进清华大学开发的新技术，用玉米淀粉发酵法生产琥珀酸，预计琥珀酸年产量为3万吨，为全国发酵法生产琥珀酸第一家。参考文献参考文献凌
14、关庭. 食品添加剂手册,第二版. 北京:化学工业出版社,1991.詹晓北，陈设，郑志永.大肠杆菌生产琥珀酸的代谢工程研究进展J过程工程学报，2007，8.张玉秀，王姣，王丹，齐峰.大肠杆菌产琥珀酸基因工程研究进展J 中国生物工程杂志,2009.张玉秀，张云剑，李强.产琥珀酸放线杆菌发酵生产琥珀酸的研究进展J中国生物工程杂志，2008.沈菲.琥珀酸发酵条件的优化和菌种选育:天津大学硕士学位论文;天津，天津大学，2003.王庆昭. 高产琥珀酸大肠杆菌的代谢工程:天津大学硕士学位论文;天津，天津大学，2006.吴婵媛. 产琥珀酸大肠杆菌代谢工程的研究:天津大学硕士学位论文;天津，天津大学，2006.
