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1、第三章第三章 地衣共生菌藻的分离、地衣共生菌藻的分离、 培养和人工重建培养和人工重建 地衣是否能分为单个生物 不同有机组织的相互关系 更多的了解地衣的生理、形态、发育和分子生物学方面的问题 次生代谢物的研究 一、共生真菌的分离和培养一、共生真菌的分离和培养 1、地衣型真菌常用的培养基、地衣型真菌常用的培养基 2、子囊孢子释放法、子囊孢子释放法 3、组织培养法、组织培养法 4、培养共生菌的保存、培养共生菌的保存 1、地衣型真菌常用的培养基、地衣型真菌常用的培养基 WA4 培养基培养基含含 4%蒸馏水的琼脂培养基蒸馏水的琼脂培养基琼脂 4g 蒸馏水补足 100ml MY 培养基培养基麦芽酵母提取物
2、培养基麦芽酵母提取物培养基麦芽提取物 20g / 酵母提取物 2g / 琼脂 20g / 蒸馏水补足 1000ml LB 培养基培养基Lilly and Barnett s 培养基培养基葡萄糖 10g / 天冬酰胺酸 2g / KH2PO4 1g / MgSO47H2O 0.5g / Fe(NO3)39H2O 0.2 mg / ZnSO47H2O 0.2mg / MnSO44H2O 0.1mg / 维生素 B1 0.1mg / 维生 素 H 5ug / 蒸馏水补足 100ml 可以在以上组分上加入 1520g 的琼脂，并补足 1000ml，并制成固体培养 基。 LBG 培养基培养基Lilly
3、and barnett gelrite 培养基培养基LB 培养基中以 1%的 Gelrite 代替琼脂。注意：在利用和倒入皮氏培养皿（5mm）或试管（5ml）之前应将所有培养基进行灭 菌。 4、培养共生菌的保存、培养共生菌的保存 共生菌可以存放很长时间共生菌可以存放很长时间 （大约一年左右）（大约一年左右） 。 通常共生菌在通常共生菌在 1520时表现出最大生长率。每种均有其最适生长时表现出最大生长率。每种均有其最适生长 PH 值，通常值，通常 PH 范围范围 为为 56。太高或太低的。太高或太低的 PH 均会阻碍其生长。均会阻碍其生长。在共生菌群体保存培养中，光并不是必须的。在共生菌群体保存
4、培养中，光并不是必须的。 地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。地衣共生菌可以在液氮中保存很长时间，仍能保持活性。 二、共生藻及蓝细菌的分离和培养二、共生藻及蓝细菌的分离和培养 1、培养基、培养基 2、培养前处理、培养前处理 3、共生藻的培养、共生藻的培养 4、无菌培养群体的分离、无菌培养群体的分离 5、共生藻培养的保存、共生藻培养的保存1、培养基、培养基BBM 培养基Bolds Basal Medium 3 N BBM 培养基Trebouxia 培养基MDM 培养基2、培养前处理、培养前处理 1）清洗）清洗 对于大型地衣（叶状和枝状）：从地衣体顶端切下约对于大型地衣（叶状和枝状）
5、：从地衣体顶端切下约 12，然后放在自来水中浸泡，然后放在自来水中浸泡 510 分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。分钟，用画笔刷在流动的自来水中清理地衣体表面，然后用无菌水冲洗。 对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣）对于小型地衣：如果地衣体较小（多壳状地衣） ，可将其放入装有，可将其放入装有 12 ml 的无菌水和一滴的无菌水和一滴 Tween20 的小试管中。超声波粉碎约的小试管中。超声波粉碎约 3 分钟。离心去除地衣体表面的附属物。分钟。离心去除地衣体表面的附属物。 2）地衣体匀浆液的制备）地衣体匀浆液的制备 大型地衣（枝状或叶状）：大型地衣（枝状或叶状
6、）： （1）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。）清洗之后，将地衣体放在一个无菌的载玻片上。 （2）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。）在解剖镜下，利用针锉平的小刀仔细刮去地衣皮层。 （3）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。）在显微镜下，取下藻层并转移到一个新的无菌的玻片上。 （4）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片，）在无菌玻片上滴一滴无菌水，用另一个玻片把切取的的共生藻层盖上，轻轻压玻片， 将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但实际上共生藻就机械地同共生将地衣体磨成较小碎片。这样，尽管仍有一些菌丝存在，但
7、实际上共生藻就机械地同共生 菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。菌分离了。两种共生体均悬浮在液体中。较小地衣体：较小地衣体：清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的清洗之后，将小部分地衣体放在无菌的载玻片之间，轻轻磨动玻片。不像大型地衣的 处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。处理，由于小型地衣没有去除表皮，故应需较大的压力。这样会得到含有菌藻的悬浊液。 也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此，也可以采用搅拌器或研钵弄碎较大片地衣。但是，搅拌器会使脆弱的细胞受到破坏，因此， 应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。应采用较温和的方法处理，如在两玻片间轻轻磨动。3、共生藻的培养、共生藻的培养 含共生藻的悬浊液 15 天培养：1520 共生藻群（1 个月左右） 要注意藻的污染4、无菌培养群体的分离、无菌培养群体的分离 直接挑选法：体视显微镜直接挑选法：体视显微镜 喷雾法喷雾法 微量吸管吸法微量吸管吸法 离心法离心法
