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1、碱裂解法抽提质粒碱裂解法抽提质粒 DNADNA实验一 碱裂解法抽提质粒 DNA实验原理质粒是存在于染色体外的小型双链环状 DNA，大小在 1-200kb之间，能在宿主菌中自主复制。宿主细胞中质粒的拷贝数各有不同，一种是低拷贝数的，每个细胞仅含有一个或几个质粒分子，称为“严紧型”复制的质粒，另一类高拷贝的质粒，拷贝数可达到 20 个以上，这种类型称为“松弛型”复制的质粒。质粒能编码一些遗传性状，如抗药性（氨苄青霉素、四环素等抗性） ，利用这些抗性可以对宿主菌或重组菌进行筛选。质粒作为基因工程载体必须具备以下条件（1）复制子（ori）：一段具有特殊结构的 DNA 序列；（2）有一个或多个便于检测的
2、遗传表型，如抗药性、显色表型反应等；（3）有一个或几个限制性内切酶位点，便于外源基因片段的插入；（4）适当的拷贝数。制备质粒载体是分子生物学的常规技术。碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA 的方法，其基本原理为：当菌体在 NaOH 和 SDS 溶液中裂解时，蛋白质与 DNA 发生变性，当加入中和液后，质粒 DNA 分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体 DNA 不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。纯化质粒 DNA 的方法通常是利用了质粒 DNA 相对较小及共价闭环两个性质。例如，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心、离子交换层析、凝胶过滤层析、聚乙二醇分级沉淀等方法，但这
3、些方法相对昂贵或费时。对于小量制备的质粒 DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒 DNA已可满足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在分子生物学实验室中常用。实验目的1、 掌握碱裂解法抽提质粒 DNA 的原理和方法。2、 掌握紫外吸收光谱法测定核酸含量的原理和方法。实验步骤1、试剂配制（1）LB 培养液10 g Tryptone，5 g Yeast Extract，10 g NaCl，双蒸水定容至1000mL，高压灭菌后 4保存。（2）LB 平板培养基在 LB 液体培养基中加入琼脂粉 15g，高压灭菌
4、，冷却至 45左右时倒平皿，4保存。（3）LA 平板培养基待 LB 液体培养基冷却至 45左右加入 Amp (100g/mL)，摇匀后倒平皿，4保存。（4）溶液 I：50 mmol/L 葡萄糖，25 mmol/L Tris-HCl(pH8.0),10 mmol/L EDTA (pH8.0), 配制 200ml。取葡萄糖（C6H12O6.H2O）1.982 g，双蒸去离子水 160 ml，0.5 mol/L EDTA 4ml，1 mol/L Tris-HCl(pH8.0) 5 ml，定容至 200 ml，高压灭菌后 4保存。（5）溶液 II：0.2 mol/L NaOH, 1%SDS。 配制 1
5、00 ml，现用现配。10 mol/L NaOH 2 ml，双蒸去离子水 80 ml，10%SDS 10 ml，最后用双蒸去离子水定容至 100 ml，室温保存。（6）溶液 III：配制 100 ml。5 mol/L 乙酸钾 60 ml，冰乙酸 11.5 ml，双蒸去离子水 28.5 ml。（7）5 mol/L 乙酸钾（200 ml）乙酸钾 98.14 g，溶解于 160 ml 双蒸去离子水中，搅拌溶解后定容至 200 ml。（8）3 mol/L 乙酸钠（NaAc） （pH5.2)取乙酸钠（CH3COONa.3H2O) 204.1g，溶解于 200 ml 双蒸去离子水中，用冰乙酸调 pH5.2
6、，双蒸去离子水定容至 500 ml，高压灭菌后 4保存。（9）10 mol/L NaOH 溶液（100 ml）NaOH 晶体 40 g，加水至 100 ml。（10）10%SDS称取 SDS 10g，溶解于 80 ml 水中，68助溶，加数滴 1 mol/L HCl 调 pH7.2,定容至 100 ml。（11）0.5 mol/L EDTA（pH8.0) （100 ml） 。Na2EDTA.2H2O 18.61 g, H2O 70 ml，边搅拌边加入 NaOH 固体调节 pH，接近 pH8.0 时才充分溶解，大约需 NaOH 2g。最后加水至100 ml。（12）TE 缓冲液（pH8.0） （
7、100 ml）10 mmol/L Tris-HCl（pH8.0） ，1 mmol/L EDTA（pH8.0） 。2、细菌的培养（1）配制 LB 液体，在琼脂糖平板培养基上划线培养出单菌落（37，16-20 小时） 。（2）在灭菌过的 10 ml 玻璃培养管中加入 3 ml LA 液体培养基、以及 3 微升 Amp (100 ug/ml)，挑取单菌落至培养基中。将培养管置于摇床中，振摇过夜(200-250 rpm,16-18 小时)。3、质粒的提取（1）吸取 1.5 毫升菌液至 1.5 ml Eppendorf 离心管中，3 000 rpm离心 3 分钟，弃上清液。（2）加上 1.5 毫升菌液，
8、重复操作（） 。（3）用移液器尽可能除去上清液，加入 150 微升溶液，用旋涡振荡器充分悬浮菌体。（4）加入 250 微升溶液,缓慢地上下翻转离心管约 10 次，混合均匀。室温下放置分钟。（5）加入 200 微升溶液，上下翻转离心管约 10 次，混合均匀，冰浴 10 分钟。，14,000 rpm 离心 5 分钟。（6）用移液器将上清液转移到新的 1.5 ml Eppendorf 离心管中，加入倍体积酚氯仿抽提，14 000 rpm 离心分钟。（7）重复步骤（6）1 次。（8）移取上清液（400500 微升） ，加入 2 倍体积无水乙醇、0.1倍体积 3 mol/L 醋酸钠，置于20冰箱 30
9、分钟。（9）14 000 rpm 离心 10 分钟，尽量去掉酒精。（10）用 0.5 ml 70酒精洗 DNA 沉淀次，离心分钟，尽量去掉酒精，风干分钟。（11）加 50 微升 TE 缓冲液溶解 DNA 沉淀，然后加入微升RNase，37过夜，20保存。4、DNA 浓度测定（1）标准曲线的制作分别用蒸馏水将 DNA 标准品配制成浓度为5g、10g、20g、30g、40g、50g/mL 的 DNA 溶液，于260 nm 处测定光吸收值，在电脑中用软件制作标准曲线。（2）样品测定取 20 微升质粒 DNA 置一干净的离心管中，加入 2 980 微升蒸馏水稀释。然后用紫外分光光度计测定 260nm 和 280nm 的光吸收值。计算 DNA 浓度，并通过 OD260/OD280 比值评估样品纯度。思考题1、在质粒提取过程中，如何避免染色体 DNA 污染？为什么？2、紫外吸收法测定核酸含量和纯度的原理是什么？3、提纯的质粒 DNA 用琼脂糖电泳检查时为什么会出现不同的电泳条带？质粒 DNA 条带有“拖尾”现象是由什么原因造成的，对以后的外源基因克隆可能产生什么影响？为什么？
