生化笔记完全版015

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1、生化笔记完全版生化笔记完全版-DNA 的复制和修复的复制和修复生物体的遗传信息储存在 DNA 中，并通过 DNA 的复制由亲代传给子代。在子代的生长发育中遗传信息自 DNA 转录给 RNA，然后翻译成蛋白质以执行各种生命功能，使后代表现出与亲代相似的遗传性状。1958 年，F.Crick 提出中心法则：（1）以原 DNA 分子为模板，合成出相同 DNA 分子的过程。（2）以某一段 DNA 分子为模板，合成出与其序列对应的 RNA 分子的过程。（3）以 mRNA 为模板，根据三联密码规则，合成对应蛋白质的过程。中心法则揭示了生物体内遗传信息的传递方向。图DNA 生物合成有两种方式：DNA 复制和

2、反转录DNA 体内复制涉及：原核、真核生物的染色体、细菌质粒（环状，双链） 、真核细胞器DNA（线粒体、叶绿体） 、病毒（双链，环状）DNA 的体外复制：分子克隆。第一节第一节DNA 的复制的复制一、一、 DNA 半保留复制半保留复制1953 年，Watson 和 Crick 在提出 DNA 双螺旋结构模型时就推测 DNA 可能按照半保留机制进行自我复制。P321 图 191 Watson 和 Crick 提出的 DNA 双螺旋复制模型在复制过程中，首先亲代双链解开，然后每条链作为模板，在其上合成互补的子代链，结果新形成的两个子代 DNA 与亲代 DNA 分子的碱基顺序完全一样，而且每个子代

3、DNA 分子中有一条链完全来自亲代 DNA，另一条是新合成的。1958 年，Meselson 和 Stahl 用15N 标记 E.coli. DNA，证明了 DNA 的复制是半保留复制。P322 图 19-2 DNA 的半保留复制。1963 年，Cairns 用放射自显影法，在显微镜下首次观察到完整的正在复制的 E. coli. 染色体DNA。P323 图 19-33H-脱氧胸苷标记 E.coli. DNA ，经过将近两代时间，用溶菌酶消化细胞壁，将 E.coli. DNA转至膜上，干燥，压感光胶片，3H 放出 粒子，还原银，在光学显微镜下观察。用这种方法证明了大肠杆菌染色体 DNA 是一个环

4、状分子，并以半保留的形式进行复制。DNA 的半保留复制可以说明 DNA 在代谢上的稳定性。经过多代复制，DNA 的多核苷酸链仍可以保持完整，并存在于后代而不被分解掉。二、二、 复制起点、单位和方向复制起点、单位和方向DNA 的复制是在起始阶段进行控制的，一旦复制起始，它就会继续下去直到整个复制子完成复制。1、 复制起点复制起点复制起点是以一条链为模板起始 DNA 合成的一段序列。有时，两条链的复制起点并不总是在同一点上（如 D 环复制） 。在一个完整的细胞周期中，每一个复制起点只使用一次，完成一次复制过程。多数生物的复制起点，都是 DNA 呼吸作用强烈（甲醛变性实验）的区段，即经常开放的区段，

5、富含 A.T。环状 DNA 复制起点的确定方法P325 图 19-6复制起点的克隆和功能分析重组质粒转化法大肠杆菌的复制起点 oriC 区 1Kb 的重组质粒在转化子中的复制行为与其染色体一样，受到严密控制，每个细胞只有 1-2 个拷贝，用核酸外切酶缩短 oriC 克隆片段的大小，最后得到 245bp 的基本功能区，携带它的质粒依然能够自我复制，拷贝数可以增加到 20 以上，这说明发动复制的序列在 245bp 的基本功能区，而决定拷贝数的序列在基本功能区之外和 1Kb 之间。鼠伤寒沙门氏菌的起点位于一段 296bp 的 DNA 片段上，与大肠杆菌的复制起始区有 86%同源性，而且有些亲缘关系较

6、远的细菌，其复制起点在大肠杆菌中亦能起作用。因此，复制起始区的结构可能是很保守的。起始序列含有一系列对称的反向重复和某些短的成簇的保守序列。2、 复制单位复制单位复制子(Replicon)：Genome 能独立进行复制的单位，每个复制子都含有一个复制起点。原核生物的染色体和质粒、真核生物的细胞器 DNA 都是环状双链分子，它们都是单复制子，都在一个固定的起点开始复制，复制方向大多数是双向的，少数是单向复制。多数是对称复制，少数是不对称复制（一条链复制后才进行另一条链的复制） 。环状 DNA 的复制眼象 ，称 形复制。真核生物的染色体 DNA 是线形双链分子，含有许多复制起点，因此是多复制子，每

7、个复制子约有 100-200Kbp。人体细胞平均每个染色体含有 1000 个复制子。病毒 DNA 多种多样，环状或线形，双链或单链，但都是单复制子。3、 复制方向复制方向定点起始，复制方向大多数是双向的（等速进行或异速进行） ，形成两个复制叉，少数是单向复制，形成一个复制叉。 用放射自显影实验判断 DNA 的复制方向及速度低放射性3H-脱氧胸苷 高放射性3H-脱氧胸苷a. 单向b. 双向等速 三种结果图形c. 双向异速 E.coli.的一个温度敏感株，在 42时，能使 DNA 在完成复制后，不再开始新的复制过程，而在25时复制功又能能恢复。4、 DNA 的几种复制方式的几种复制方式（1 1）

8、、直线双向复制直线双向复制单点，双向，T7多点，双向，真核染色体 DNA（2 2） 、 型复制：环状双链型复制：环状双链 DNADNA，单向或双向（，单向或双向（E E .coli.coli.）（3 3） 、滚环复制：环状单链滚环复制：环状单链 DNADNA，x174x174（4 4） 、D D 环复制：线粒体、叶绿体环复制：线粒体、叶绿体 DNADNA（5 5） 、多复制叉复制：多复制叉复制：第一轮复制尚未完成，复制起点就开始第二轮的复制。 在 E.coli.富营养时，可采取多复制叉复制方式。E.coli. DNA 的复制最快可达 50Kb/min，完全复制需 40min，富营养时，20mi

9、n 分裂。而真核染色体要 6-8 小时。三、三、 与与 DNA 复制有关的酶及蛋白质因子复制有关的酶及蛋白质因子目前已发现 30 多种酶及蛋白质因子参与 DNA 复制（一）（一）DNA 的聚合反应和聚合酶的聚合反应和聚合酶DNA 生物合成 5，3，化学合成 3，5，1、 DNA 聚合反应必备的条件聚合反应必备的条件 DNA 聚合酶 DNA 模板(反转录时用 RNA 模板) 引物 (DNA、RNA 或蛋白质) 4 种 dNTP Mg2+2、 聚合反应过程及特点聚合反应过程及特点总反应式：n1dATP DNA pol . dAMPn2dGTP +DNA dGMP DNA+（n1+n2+n3+n4）

10、PPin3dCTP Mg2+ dCMPn4dTTP dTMPP329 图 19-10 P330 图 19-11在链的延长过程中，链的游离 3，-羟基，对进入的脱氧核糖核苷三磷酸 磷原子发生亲核攻击，生成 3，.5，-磷酸二酯键，并脱下焦磷酸。DNA 聚合酶的反应特点： 以 4 种 dNTP 为底物 反应需要接受模板的指导，不能催化游离的 dNTP 的聚合。 反应需有引物 3，-羟基存在 链生长方向 5， 3， 产物 DNA 的性质与模板相同3、 由由 DNA 聚合酶催化的几种聚合酶催化的几种 DNA 聚合类型聚合类型P331 图 19-12 （1） 发荚环结构：加入单链 DNA 作为模板和引物

11、，3羟基端回折成引物链。（2） 末端延伸聚合：加入双链 DNA 作为模板和引物，3末端突出作为模板。（3） 分枝型和切口平移型聚合：加入双链 DNA，聚合发生在切口或末端单链区。（4） 环形聚合：加入带引物的环形 DNA 作为模板。4、 E.coli DNA 聚合酶聚合酶（1 1） 、E.coli.E.coli. DNADNA pol.Ipol.I（KornbergKornberg 酶，酶，400400 copy/cellcopy/cell）单体酶，分子量 109Kd，含一个 Zn2+，每个细胞中含 400 个 DNA pol.催化活性：5， 3， 聚合活性3， 5， 外切活性5， 3， 外切

12、活性用蛋白水解酶将 DNA pol.部分水解可得：大片段（Klenow） ，75Kd，活性：5， 3，聚合活性、3， 5，外切活性。小片段，36Kd，活性：5， 3，外切活性（只作用于双链 DNA 的碱基配对部分，切除修复） 。Klenow 片段的用途：a 补齐 DNA 3，隐缩未端b. 标记 DNA 片段未端ccDNA 合成第二链 dd DNA 测序（2 2） 、E.coli.E.coli. DNADNA Pol.Pol.（100100 copy/cellcopy/cell）单体酶，分子量 120Kd催化活性：5， 3，聚合(活性很低)3， 5，外切可能在 DNA 的修复中起某中作用。（3

13、3） 、 E.coli.DNAE.coli.DNA pol.pol.（复制酶，（复制酶，10-2010-20 copy/cellcopy/cell）寡聚酶，全酶由 10 种共 22 个亚基组成，、 和 三种亚基组成核心酶。P334 表 10-3DNA pol.是合成新链 DNA 主要的酶，又称复制酶(Replicase)Pol.的 5，3，外切酶活性只作用于单链 DNA。P334 表 19-2 E.coli 三种 DNA 聚合酶的性质比较DNA 聚合酶有 6 个结合位点 模板 DNA 结合位点 引物结合位点 引物 3，-OH 位点、反应位点 底物 dNTP 结合位点 5， 3， 外切位点(po

14、l.没有) 3， 5， 外切位点(校正)5、 真核生物真核生物 DNA 聚合酶聚合酶P334 表 19-4 真核生物 DNA 聚合酶真核 DNA 聚合酶一般不具备外切活力，可能由另外的酶在 DNA 复制中起校正功能。 DNA 聚合酶 ，多亚基，功能与 E.coli. pol.类似，是真核 DNA 复制酶。 DNA 聚合酶 ，主要在 DNA 损伤的修复中起作用。 DNA 聚合酶 ，从线粒体得到，可能与线粒体 DNA 的复制有关。 DNA 聚合酶 ，特点：有 3， 5，外切活力。（二）（二）引物酶或引物酶或 RNA 聚合酶（引发酶）聚合酶（引发酶）细胞内，DNA 的复制需要引物（DNA 或 RNA

15、） ，引物酶或 RNA 聚合酶可合成 6-10 个碱基的 RNA 引物。DNA 复制为什么要用 RNA 引物？（为什么 DNA 聚合酶要用引物，RNA 聚合酶不需要引物？ ）P338 从模板复制最初几个核酸时，碱基堆集力和氢键都较弱，易发生错配新复制的最初几个核苷酸，没有与模板形成稳定双链，DNA 聚合酶的 5，3，校对功能难发挥作用。（三）（三）解螺旋酶解螺旋酶大肠杆菌的解螺旋酶、与 rep 蛋白共同作用，将 DNA 两条链解开。解螺旋酶 I、II、III 沿着模板链的 53方向随着复制叉的前进而移动，而 rep 蛋白则在另一条模板链上沿 35方向移动。（四）（四）DNA 旋转酶旋转酶属 DNA 拓扑异构酶，可引入负超螺旋，消除复制叉前进时带来的扭曲张力。拓扑异构酶分两类：I 和 II，广泛存在于原核生物和真核生物。拓扑异构酶 I 使 DNA 的一条链发生断裂和再连接，反应无须供给能量，主要集中在活性转录区，与转录有关。拓扑异构酶使 DNA 的两条链同时断裂和再连接，当它引入超螺旋时需要由 ATP 供给能量。分布在染色质骨架蛋白和核基质部，与复制有关。（五）（五）单链单链 DNA 结合蛋白（结合蛋白（SSB）复制叉上的解螺旋