细胞活化与细胞复苏

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1、1. 收到细胞株包裹时， 请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形， 若有请立即通 知。细胞株请尽速开始培养， 或立即冷冻保存(置于70 C， 隔夜后， 移 到 liq N2)。细胞复苏的原则快速融化：必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至 37，使细胞外冻存时的冰晶迅 速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。具体操作一. 实验前准备：1.将水浴锅预热至 372.用 75酒精擦拭紫外线照射 30min 的超净工作台台面。3.在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等等。二取出冻存管：1.根据细胞冻存记录按标签找到所需细胞的编号。2.从液氮罐中取出细胞盒，取出所需

2、的细胞，同时核对管外的编号。三迅速解冻：1.迅速将冻存管投入到已经预热的水浴锅中迅速解冻，并要不断的摇动，使管 中的液体迅速融化。2.约 1-2min 后冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，再 拿入超净台内。四.平衡离心：用架盘天平平衡后，放入离心机中 3000r/min 离心 3min五.制备细胞悬液：1.吸弃上清液。2.向离心管内加入 10ml 培养液，吹打制成细胞悬液。六.细胞计数：细胞浓度以 5105/ml 为宜。七.培养细胞将复合细胞计数要求的细胞悬液分装入培养瓶内，将培养瓶放入 3 7和 5CO2 的培养箱内 2-4 小时（或者 24-48 小时）后换液继续培养培

3、养， 换液的时间由细胞情况而定。初学者易犯错误：1 水浴锅未预热或者未预热到 37。2.水浴锅内冻存管太多，导致传热不佳，使融化时间延长。3.离心前忘记平衡，导致离心机损坏和细胞丢失。4.一次复苏细胞过多，忘记更换吸头和吸管，导致细胞交叉污染。（另：冷冻细胞解冻程序）2.1. 依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和 比例， 制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同 之血清种类， 若因实验需要， 必须有所不同时， 务必以缓慢比例渐次改变培 养基组成， 确定细胞适应后， 方进行所需之实验。2.2. FBS (fetal bovine serum, 胚

4、牛血清), CS (calf serum, 小牛血清)和 HS (horse serum, 马血清)，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单 指定之血清种类培养之。2.3. 将培养基置于 37 C 水槽中回温，回温后喷以 70 % 酒精并擦拭之， 移 入无菌操作台内。取出冷冻管， 立即放入 37 C 水槽中快速解冻， 水面高 度不可接近或高过冷冻管之盖沿， 否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在 1 分 钟内全部融化后， 以 70 % ethanol 擦拭冷冻管外部， 移入无菌操作台内。2.4. 依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取 10 ml 培养基加至 T25 或 T75 flask 中。取

5、出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入 T25 或 T75 flask 内之培养基 ， 混 合均匀，放入 37 C，5 % CO2 培养箱培养。2.5. 对绝大多数细胞而言，1 % 以下之冷冻保护剂 DMSO，不会对细胞之贴附 或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴 附良好后再去除即可。唯对极少数因对 DMSO 敏感或会造成细胞分化之细胞， 需立即去除 DMSO 者， 则可将解冻后之细胞悬浮液放入 5 - 10 ml 培养基中, 离心 300 xg (约 1000 rpm)，5 分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基 ，将细胞均匀混合后， 转移至培养瓶中， 再放入 37

6、 C， 5 % CO2 培养箱 培养。收到 T25 flask 细胞时， 处理方式为1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask 均加满培养基。 请检查 flask 外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任 何问题， 不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。2. 将原封之 T25 flask 静置于 37 C， 5 % CO2 培养箱中，使细胞回温至 3 7 C， 并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作 箱内取出 flask 内之培养基，(取出之培养基可以再使用)，仅留约 5-10ml 培养基于 flask 内，依 一般培养方式再将细胞置入培养箱中或细胞已长满盘， 则将细胞做传代培养。