固相萃取基本原理与应用

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1、一、固相萃取基本原理与操作一、固相萃取基本原理与操作 1、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理、固相萃取吸附剂与目标化合物之间的作用机理 固相萃取主要通过目标物与吸附剂之间的以下作用力来保留/吸附的 1）疏水作用力：如 C18、C8、Silica、苯基柱等 2）离子交换作用：SAX, SCX，COOH、NH2等 3）物理吸附：Florsil、 Alumina 等 2、pH 值对固相萃取的影响值对固相萃取的影响 pH 值可以改变目标物/吸附剂的离子化或质子化程度。对于强阳/阴离子交换柱 来讲，因为吸附剂本身是完全离子化的状态，目标物必须完全离子化才可以保 证其被吸附剂完全吸附保留。而目标物的

2、离子化程度则与 pH 值有关。如对于 弱碱性化合物来讲，其 pH 值必须小于其 pKa 值两个单位才可以保证目标物完 全离子化，而对于弱酸性化合物，其 pH 值必须大于其 pKa 值两个单位才能保 证其完全离子化。对于弱阴/阳离子交换柱来讲，必须要保证吸附剂完全离子化 才保证目标物的完全吸附，而溶液的 pH 值必须满足一定的条件才能保证其完 全离子化。3、固相萃取操作步骤及注意事项、固相萃取操作步骤及注意事项 针对填料保留机理的不同（填料保留目标化合物或保留杂质），操作稍有不同 。 1）填料保留目标化合物）填料保留目标化合物 固相萃取操作一般有四步（见图 1）： 活化- 除去小柱内的杂质并创造

3、一定的溶剂环境。（注意整个过程 不要使小柱干涸） 上样- 将样品用一定的溶剂溶解，转移入柱并使组分保留在柱上。 （注意流速不要过快，以 1ml/min 为宜，最大不超过 5ml/min） 淋洗- 最大程度除去干扰物。（建议此过程结束后把小柱完全抽干 ） 洗脱- 用小体积的溶剂将被测物质洗脱下来并收集。（注意流速不 要过快，以 1ml/min 为宜）如下图 1:2）填料保留杂质）填料保留杂质 固相萃取操作一般有三步（见图 2）： 活化-除去柱子内的杂质并创造一定的溶剂环境。（注意整个过程不要 使小柱干涸） 上样-将样品转移入柱，此时大部分目标化合物会随样品基液流出，杂 质被保留在柱上，故此步骤要

4、开始收集（注意流速不要过快） 洗脱-用小体积的溶剂将组分淋洗下来并收集，合并收集液。（注意流 速不要过快） 此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。此种情况多用于食品或农残分析中去除色素。 如下图 2：二、固相萃取方法的建立与优化二、固相萃取方法的建立与优化 固相萃取技术使用起来虽然比液液萃取简单，但建立一个固相萃取的方法并无 快捷方式可走。建立固相萃取方法必须考虑与萃取过程相关的多种因素，归纳 起来可通过下图来了解： 方法建立如下图片 1.jpg：方法建立如下图片 2.jpg：1、初步固相萃取方法的建立 建立初步的萃取方法要考虑: 选择合适的 SPE 柱 选择合适的固相萃取方法 方法的优化

5、2、固相萃取柱的选择 1）柱填料的选择）柱填料的选择 首选根据目标化合物与干扰物的差异，如极性，分子量，pka 值等，选择合适 的填料。 固相萃取柱的选择如下图片.jpg：2）固相萃取柱规格的选择）固相萃取柱规格的选择 对于反相、正相和吸附型固相萃取柱来说，被萃取样品的质量不超 SPE 柱填料 的 5%（参考值，同一种 SPE 柱对不同的目标物选择性不同，吸附容量不同） ；而离子交换型的固相萃取柱，必须考虑离子交换的容量。不同厂家的小柱离 子交换容量稍有差异。下表附 SPE 小柱的容量和洗脱参数SPE 柱上样容量和洗脱体积的选择柱上样容量和洗脱体积的选择 规格规格最大上样量最大上样量最小洗脱体

6、积最小洗脱体积 100mg/1mL5mg250L 200mg/3mL10mg500L 500mg/6mL25mg1.2mL 1g/6mL50mg2.4mL3、选择合适的固相萃取方法、选择合适的固相萃取方法 固相萃取的保留机制可分为两种：固相萃取的保留机制可分为两种： 吸附剂（填料）保留目标化合物：绝大多数化合物应用此机制，填料保留其目 标组分及少量杂质，通过淋洗步骤去除吸附在柱上的少量杂质，最后选择合适 的（洗脱）溶剂把目标组分洗脱下来。 根据吸附剂的保留机理可进一步分为：根据吸附剂的保留机理可进一步分为： （1）反相（）反相（C18,C8,CN,Phenyl,C4,C1） 分析物：非极性至中

7、等极性 基质：水溶性 方法： a.活化：通常用水溶性有机溶剂如甲醇活化，然后用水平衡 b.淋洗：含 0-50%极性溶剂的缓冲溶液淋洗杂质 c.洗脱：极性或非极性溶剂洗脱目标物 （2）正相（）正相（Silica, Florisil,Diol,NH2） 分析物：中等极性到强极性 基质：非极性至中等极性 方法： a.活化：非极性有机溶剂活化：非极性有机溶剂 b.洗脱：非极性有机溶剂洗脱：非极性有机溶剂如下图片：（3）阳离子交换（）阳离子交换（SCX,PRS,COOH） u 分析物：阳离子（碱性）化合物 u 方法： 1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性 溶剂中的样品时

8、，可用水溶性有机溶剂过柱后，然后用水平衡，最后再用适当 pH 值的缓冲溶液进行平衡。 2.上样：样品溶液 pH 值要小于小于其 pKa 两个单位（以保证其带电荷 ） 3.洗脱：洗脱溶液 pH 值要大于大于其 pKa 两个单位（中和分析物的电荷） （4）阴离子交换（）阴离子交换（SAX,PSA,NH2，PAX/MAX ） u 分析物：阴离子（酸性）化合物 u 方法： 1.活化：用于非极性有机溶剂中的样品时，可用样品溶剂来活化；在用于极性 溶剂中的样品时，可用水溶性有机溶剂活化后，然后用水平衡，最后再用适当 pH 值的缓冲溶液进行平衡。 2.上样：样品溶液 pH 值要大于大于其 pKa 两个单位（

9、以保证其带电荷 ）。 3.洗脱：洗脱溶液 pH 值要小于小于其 pKa 两个单位（中和分析物的电荷）。 u 吸附剂（填料）保留杂质： 食品中色素等杂质的去除多用此机制。填料保留杂质而不保留或只保留极少量 的目标组分，所以上样后即开始收集目标组分，最后用目标物所在的溶剂进一步洗脱。合并两部分收集液。 （1）活化：以样品所在的有机溶剂进化活化，1-2 柱管体积 （2）上样：提取液转移至柱内，并收集流出液 （3）洗脱：用样品所在的有机溶剂进一步洗脱，收集流出液。合并上样和洗脱 流出液。 4、固相萃取方法的优化、固相萃取方法的优化 1）影响萃取效率的因素）影响萃取效率的因素 （1）填料（固定相）填料（

10、固定相）- 核心核心 选择合适的 SPE 柱是保证理想结果的前提。 （2）洗脱溶剂的强度：）洗脱溶剂的强度： 采用正相固定相时，溶剂强度随其极性增强而增加； 采用反相固定相时，溶剂强度随极性减弱而增强。 （3）pH 值：值：离子交换固定相、被分析物和干扰物质的 pKa 各不相同。通过调节 pH 大 小，可以使固定相带电荷，被分析物带相反电荷，而使干扰物质不带电荷；或 者反过来，使固定相带电荷，干扰物质带相反电荷，而使被分析物不带电荷。 （4）操作：）操作：控制合适的流速、活化的时不要让柱干涸等 2）常见问题及解决方法）常见问题及解决方法 分析物回收率低 萃取重现性差 洗脱馏分中含有干扰物 SP

11、E 柱流速降低或阻塞 具体解决方案如下： A. 分析物回收率低分析物回收率低 未保留？ 被淋洗？ 未被洗脱或部分洗脱？ 首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源首先要把上样液、淋洗液、洗脱液均收集，进样分析，确定问题来源回收率差如下图片回收率差如下图片 ：重现性差如下图片：重现性差如下图片：相关图片如下 ：相关图片如下：举例说明举例说明1. 参考文献方法用 C18 柱做相关药物的净化，过柱方法如下：分别用乙酸 乙酯、甲醇和水活化小柱，然后把处理过的样品过柱（溶剂为具一定 pH 值的 缓冲溶液），水淋洗小柱后，用乙酸乙酯洗脱目标物。结果：接受液混浊状，回收率和重现性都不理想，

12、可能是什么原因呢？结果：接受液混浊状，回收率和重现性都不理想，可能是什么原因呢？ 答案：正确的做法是要在淋洗过程结束后把小柱完全抽干。原因有二，其一因 为淋洗溶剂（水）与洗脱溶剂（乙酸乙酯）不互溶，如果不抽干洗脱溶剂与目 标物不能充分作用，所以造成回收率和重现性都没有保证，同时从外观上看 接 受液是液混浊液；其二如果淋洗过程不抽干小柱，洗脱溶剂里会引入水（淋洗 剂），对下一步浓缩造成很大的困难。 相关图片如下：2、水中的灭草松前处理方法 取 500ml 水样过滤，待过 Cleanert PEP 柱（相当于 Waters HLB）净化 1） 用 5mL 四氢呋喃洗柱子，除掉杂质 2） 用 5mL

13、 甲醇 1mL/min 活化柱子 3） 用 5mL 纯水 1mL/min 活化柱 4） 500mL 的水样以 5mL/min 的速度过柱 5） 5mL 纯水 2mL/min 淋洗 6） 小柱真空抽干 20min 7） 0.9mL 的甲醇 1mL/min 淋洗，弃去淋洗液 8） 3mL 四氢呋喃 1mL/min 的速度洗脱柱子，收集洗脱液浓缩定容至 3mL 液 相检测。 结果：回收率不理想，请问此方法有何问题？结果：回收率不理想，请问此方法有何问题？答案：因为目标物灭草松呈酸性，答案：因为目标物灭草松呈酸性，pKa=3.3，而选择的小柱，而选择的小柱 PEP 是极性的。所是极性的。所 以正确的做

14、法是样品在过柱之前一定要调节水样的以正确的做法是样品在过柱之前一定要调节水样的 pH 值小于等于值小于等于 3，使目标，使目标 物分子化，以保证目标物能被小柱充分保留，否则在上柱的过程中容易造成物分子化，以保证目标物能被小柱充分保留，否则在上柱的过程中容易造成“漏漏 ”的现象，从而造成回收率差。的现象，从而造成回收率差。三、固相技术应用实例解析三、固相技术应用实例解析 1、食品领域应用、食品领域应用 1）动物组织中盐酸克仑特罗等）动物组织中盐酸克仑特罗等 4 种种 -激动剂药物残留检测（激动剂药物残留检测（Cleanert PCX, P/N: CX1506） 1.实验材料实验材料 1.1 固相

15、萃取小柱：PCX(150mg/6mL) 1.2 四种 -激动剂药物：盐酸克仑特罗、沙丁胺醇、西马特罗、莱克多巴胺等 4 种 -激动剂药物。 2. 试样的制备试样的制备 取猪肝空白样品，经过液液萃取初步处理后，添加适宜浓度的标准溶液作为空 白添加试样。3. 净化净化依次用甲醇 5mL、水 5mL 和 30mmol/L 盐酸 5mL 润洗固相萃取小柱，将上 述备用液过柱，依次用水 5mL、甲醇 5mL 淋洗，真空抽干，用 4%氨化甲醇 5 mL 洗脱 PCX 小柱，收集洗脱液于具塞玻璃试管中，50下氮气吹干。在样液 过柱和洗脱过程中流速控制在 1mL/min 左右。 4. 衍生化及检测衍生化及检测 将上述盛有残渣的具塞玻璃试管放入 50烘箱中加热片刻，除去水分后，加入 甲苯 100mL 和双三甲基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100mL，涡旋振荡 20s， 密封玻璃塞，置于 80恒温烘箱中加热 1 小时，冷却后加入 300mL 甲苯，作 为试样溶液，供气相色谱-质谱分析（色谱柱：DA-5MS, 30m0.25mm0.25 m，P/N:1525-3002）。 5. 结果结果 5.1 回收率实验（精密度和准确度） 将猪肝空白样品经过液液萃取初步处理后，分别添加一定量的标准溶液，配制 1g/L、2g/L、5g/L、10g/L