植物组织的培养

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1、植物组织的培养植物组织的培养植物组织培养泛指在无菌的条件下，将离当的培养条件，使其长成完整的植株的过程。 由于培养的对象大多是脱离植物母体的外植体，培养的器皿一般是在试管内，所以植物组织 培养也叫离体体外培养或试管培养。以往由于植物组织培养的对象多是从植物体上获取材料 后，再将材料切成小块的组织而用于培养，培养结果也多是形成、培愈伤组织，因此，将对 植体的植物器官如植根、茎、叶、花、果实等，组织分生组织、次不同养结果不同而派生出 若干分支。花药组织、胚乳、皮层等，细胞体细胞、性细胞以及原生质体等，培养在人工配 制的培养基上，给予适物小块组织的培养即对植物组织的培养狭义地称为植物组织培养。植物组

2、织细胞培养作为一门技术科学，起始于 1902 年 Haberlandt 最早发表的关于植物 叶细胞培养的工作以及细胞全能性理论的提出。1667 年细胞的发现、1756 年愈伤组织概念 的提出、1838 年植物细胞学说的创立等都为植物组织培养的兴起起到了促进作用。在植物 细胞具有全能性的观点影响和启发下，人们尝试将植物的器官、组织或细胞从母体植株上取 下，放在体外的人工设计的无菌环境中让其生长发育，以了解这些器官、组织或细胞的生长 发育的规律，以及掌握控制其生长发育过程的条件和因素。一些有代表性的工作如下：以萝 卜和辣根的胚为培养材料，放人无机盐溶液与有机成分的培养基上培养，结果发现离体胚均 可

3、充分发育并能提早萌发形成小苗，首次获得胚培养成功。(1925)以亚麻种间杂种幼胚为 培养材料，成功地诱导了杂种幼胚的发育，并得到了杂种植株。我国学者李继侗等(1933)也 曾以银杏胚为培养材料进行离体胚培养，结果发现，3mm 以上大小的胚在离体条件下可正常 发育，并生长成为植株；还发现银杏胚乳提取物能促进银杏离体胚的生长。这一发现对后来 使用植物胚乳汁液或果实的提取液以促进培养组织的生长发育具有启蒙的意义。在 20 世纪 30 年代以前进行的植物组织培养，主要使用的是较大的培养材料，主要是无机盐溶液和有 机糖类，因而培养的效果并不明显。这就提示人们需要改进培养基的成分，才能使离体培养 获得真正

4、的成功。(1934)在无机盐和糖类的培养基中加入了酵母抽提物，以番茄根尖切段为 材料，进行了离体培养，结果发现离体根在此培养基上可生长，建立了第一个活跃生长的无 性繁殖系。(1937)发现 B 族维生素对培养的离体根的生长具有重要作用。他们的这些工作启 发了人们在进行植物组织培养时，在培养基中加入这些因子，以促进培养材料的生长发育。 这一阶段，在植物组织培养方面所作的都是一些探索性的工作，一方面建立了植物组织培养 的综合培养基，包括无机盐成分、有机糖成分和生长刺激因素，这是随后创立的各种培养基 的基础。另一方面培养材料也扩大到已分化完全的器官和组织，如根和形成层，同时也建立 了进行植物组织培养

5、的基本方法，这些方法也已成为当今各种植物组织培养技术的基础。但 这一阶段并没有取得植物组织培养的真正成功。是第一部有关植物组织培养技术的专著。植物组织细胞培养技术的应用研究阶段是用组织培养法快速繁殖植物，这是组织培养应 用于生产实践的最主要和最有成效的方面。首先在兰花上获得成功。Morel(1960)通过组织 培养法得到兰花组培苗后，很快将这一技术应用于生产。现已形成了组织培养法繁殖兰花工 业。利用植物组织培养快速繁殖技术进行苗木工厂化生产，在很多国家已成为一种新兴的产 业。在组织培养法成功应用的同时，原生质体培养技术也受到了重视。因为原生质体可以从 外界摄取病毒、细菌颗粒以及蛋白质、核酸等一

6、些大分子。故原生质体是基因工程研究的好 材料，可作为转基因的受体材料。但科间杂种细胞再生植株还未成功。因而，此项技术给植 物远缘杂交的遗传育种研究带来深远的影响。花药内含单倍体的小孢子，应用花药培养技术 可诱导小孢子发育成单倍体的植株。单倍体在遗传育种上具有较重要的意义。第一个通过此方法育成的单倍体品种是烟草，以后又育成了应用于生产的水稻、小麦等新品种。花药培养 技术的应用也推动了花药培养技术的基础研究。如今，通过花药或花粉培养进行的单倍体育 种，已经成为一种崭新的育种手段，有些作物新品种已开始走向大面积种植。用茎尖培养培 育无病毒植株是应用植物组织培养技术解决生产问题的突出例子。Morel(

7、1952)首先用大丽 花为材料培育出了无病毒植株。1955 年，他又以马铃薯为材料培育出了马铃薯无病毒植株。 这是茎尖培养用于植株脱毒去除植株内存在的病毒最成功的例子之一。近年来利用植物组织和细胞培养技术，还开展了植物体细胞胚胎发生及研制人工种子的 工作。所谓人工种子指的是在植株体外形成的种子。在人工条件下，将从植物体细胞中诱导 的胚状体，采用理化因子、控制同步生长等方法大量繁殖后，在胚状体表面包上一层有机物 质，这样所形成的种子就是人工种子。此项工作为加速种苗生产提供了新的途径。现已在芹 菜、土豆、西红柿、等植物上获得成功。 植物组织培养的发展前景有目前我国共有较大型的植物组织培养快繁企业

8、100 多家，主要繁 殖花卉、果树和经济树木的良种苗木。但年生产能力多在 100 万株以下，且 90以上的企 业实际处于亏损状态。其中的主要问题有两个：一是生产规模太小，二是生产成本太高。这 两个问题是相互联系的。只有通过扩大规模，降低成本，才能充分发挥这种高新技术在现代 植物生产和农业产业化中的重要作用。植物组织培养技术的发展主要体现在以下三个方面： 组培容器的大型化目前大量使用的是玻璃或耐高温塑料制成的三角瓶、罐头瓶，最大体积不超过 500 毫升。 通过模拟植物在微生态条件下的气体交换、营养吸收、形态建成，计算植物微群落生长的最 佳空间形状与大小，依此改进容器形态，扩大体积，增加单位培养面

9、积中组培苗的数量。同 时改良封口材料，以达到优质(通气隔菌)、方便、耐久的目的。 组培技术的简单化这里主要是指免转接一步成苗。培养基的配制与组培材料的转接是植物组培快繁的两大 主要日常工作，而实际上植物的正常生长只需水分、矿质营养、空气等，并不需要经常移植。 经常移植还会对植物的生活力造成一定程度的影响。在培养基成分分析与植物营养分析的基 础上，可通过培养容器中水分、矿质、激素和气体的交换与调整，实现免转接一步成苗。这 其中包括组培苗根原基的诱导与瓶外生根。 组培环境的自然化除培养基原料和人工费之外，目前组培快繁企业的最大支出是能源费。某些地方实行的 自然光照培养，虽然减少了照明用电，但却极大

10、地增加了夏季降温和冬季加温的能源费。二 者相比，得不偿失。通过对光、温、气(含真菌、水汽)的综合调控，可达到恒温、恒光、恒 湿、无菌的低成本运行。就组织培养在植物生产中的应用研究来看，如果说 20 世纪 80 年代初、中期是我国植物 组织培养的研究工作的高潮，那么到了 90 年代末期，我国植物组织培养已经迎来了第二个 高潮，即组织培养技术应用的高潮。随着我国农村产业结构的调整，植物组织培养技术作为 最具应用价值的农业高新技术，受到了广泛的重视。各级政府、国有企业和私有企业都在应 用组培技术从事花卉、果树或经济林木的脱毒、快繁。组织培养从研究到生产，必须经过中 间试验阶段，而这往往成为限制组培产

11、业化的瓶颈。因此，生产单位必须加强与科研单位的 协作，科研单位也要与生产实践相结合，共同推动我国组培产业化的进展。实验室一个标准的组织培养实验室应当包括：洗涤室、配置室、无菌室、培养室、观察 室等。在实际中可结合实际条件，合并一部分。1 洗涤室洗涤室用于完成玻璃器皿等仪器的清洗、干燥和贮存。室内应配备大型水槽， 最好是硬塑深水槽，防止碰坏玻璃器皿。上下水道要畅通。备有塑料筐，用于运 输培养器皿。备有干燥架，用于放置干燥涮净的培养器皿。 2 准备室准备室要求明亮、通风。在准备室内要完成培养基制备以及试管苗出瓶、清 洗与整理工作。如果房间较多，可将准备室分为洗涤室和配置室两部分。洗涤室 专门负责试

12、管苗出瓶与培养器皿的清洗工作；配置室则负责培养基的配制、分装、 包扎和高压灭菌等工作。为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：(1)大型工作台 其高度应方便配制工作。(2)药品柜 用于放置常用药品。(3)普通冰箱 主要用于贮存母液、各种易变质、易分解的化学药品以及植物材料 等。(4)电子分析天平和托盘天平 电子分析天平，用于称取大量元素、微量元素、维 生素、激素等微量药品精确度为 00001g；托盘天平用于称取用量较大的糖和 琼脂等，其精确度为 01g。天平应放置在干燥、不受震动的天平操作台上。(5)电蒸馏水器 电蒸馏水器，采用硬质玻璃或金属制成。蒸馏水用于配制母液或 培养基，配制

13、培养基可用自来水来代替，若实验要求严格的话，则须用蒸馏水。(6)磁力搅拌器 磁力搅拌器用于加速搅拌难溶的物质，如各种化学物质、琼脂粉 等。磁力搅拌器还可加热，使之更利于溶解。(7)恒温水浴锅 恒温水浴锅用于难溶药品的溶解、琼脂的溶化等。 (8)电炉或电饭锅 电炉的功率为 1500 或 2000W，并配有铝锅。电饭锅的功率 1000W，用于琼脂的溶化。(9)酸度计 组织培养中培养基 pH 值的准确度是十分重要的，应当使用酸度计， 若无酸度计，也可使用 pH 试纸进行粗测。首次使用酸度计前，应用标准液调节定位，然后固定。测量 pH 值时，待测 液必须充分搅拌均匀。如果培养基温度过高，测量时要调整

14、pH 值计上的温度扭使之和培养基温度相当。注意保护好玻璃电极，用后电极应用蒸馏水冲洗净，盖 上电极帽。 (10)培养基分装设备 小型操作时可采用烧杯直接分装。大型实验室可采用医用 “下口杯”作为分装工具，在“下口杯”的下口管上套一段软胶管，加一弹簧止 水夹，使用时非常合适。更大规模或要求更高效率时，可考虑采用液体自动定量 灌注设备。(11)高压灭菌锅 用于进行培养基和器械用具的灭菌。小规模实验室可选用小型 手提式高压灭菌锅。如果是连续的大规模生产，应选用大型立式的或卧式的高压 灭菌锅。通常以电作能源。(12)恒温培养箱 用于植物材料的培养，其内有温度感受器，控制箱内温度到所 调指标。生化培养箱

15、还配有光照装置。 (13)烘箱 用于干燥洗净的玻璃器皿，也可用于干热灭菌和测定干物重。用于干 燥需保持 80-100；进行干热灭菌需保持 150，达 1-3h；若测定干物重，则 温度应控制在 80烘干至完全干燥为止。3 接种室接种室是进行植物材料的分离接种及培养物转移的一个重要操作室。其无菌 条件的好坏对组织培养成功与否起重要作用。在工作方便的前提下，接种室宜小不宜大，一般 7-8m2，要求地面、天花板 及四壁尽可能密闭光滑，易于清洁和消毒。配置拉动门，以减少开关门时的空气 扰动。接种室要求干爽安静，清洁明亮。在适当位置吊装 1-2 盏紫外线灭菌灯， 用以照射灭菌。最好安装一小型空调，使室温可

16、控，这样可使门窗紧闭，减少与 外界空气对流。接种室应设有缓冲间，面积 2m2 为宜。进入无菌操作室前在此更衣换鞋，以 减少进出时带人接种室杂菌。缓冲间最好也安一盏紫外线灭菌灯，用以照射灭菌。接种室的主要设备及用具有：(1)接种箱 在投资少的情况下，可以用接种箱来代替超净台。接种箱依靠密 闭、药剂熏蒸和紫外灯照射来保证内部空间无菌。但操作活动受限制，准备时间 长，工作效率低。(2)超净台 优点是操作方便自如，比较舒适，工作效率高，准备时间短。开 机 10 分钟即可操作，可进行长时间使用。在工厂化生产中，接种工作量很大， 需要经常长久地工作时，超净台是很理想的设备。超净台功率在 145-260W 左右， 它装有小型鼓风机，使空气穿过一个前置过滤器，在这里把大部分空气尘埃先过 滤掉，然后再使空气穿过一个细致的高效过滤器，它除去了大于 03m 的尘埃、细菌和真菌孢子等，最后以较洁净的气流吹到工作台面。超净空气的流速为每分 钟 24-30m，这已足够防止附近空气袭扰而引起的污染，这样的流速也不会妨碍 采用酒精灯对器械等的灼烧消毒。在这样的无菌条件下操作，就可以保证无菌