《CFDASE标记的兔视网膜色素上皮细胞移植及术后观察》由会员分享，可在线阅读，更多相关《CFDASE标记的兔视网膜色素上皮细胞移植及术后观察（28页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、cFD A . sE 标记的兔视网膜色索上皮细胞移植及术后观察中 文 摘 要目的 新型染料梭基荧光素乙酞乙酸 仁 5 一 ( an击6 卜carbox y f 1 U re。 帕ind i a C e t a t e ， S u c c i n l m i d y l e s t e r ， C F D A 一 S E 与 眼 底 照 相， 光 学 相 关 断 层扫描 ( ocT )及免疫组化方法相结合在视网膜色素上皮细胞( retinalp i g n e n te p i t h e l i 。 。c e l l 。 ， R p EC。 ) 移 植中的 应用研究。方法用C F DA一 S
2、E( 1 0 p m o l / L ) 标记供体R P ECs ， 3 ? 下孵育I m i m ， 通过玻璃体视网膜显微手术将细胞悬液植入同种异体青紫蓝兔视网膜下腔， 术后用眼底照相，OCT 等追踪观察并分别在 3 0d和6 0d 时处死实验兔，荧光显微镜下观察标记的 供体细胞，同时作紧密连接的结构蛋白 2 于1 和细胞骨架蛋白A c t i n 的免疫组化分析。结果荧光显微镜下观察到标记的供体R P E Cs可嵌插于宿主R P E C s 之间， 铺成单层结构，并形成新的 细胞间 紧密连接( t i g h t j u n c t i o n s ， T J 。 ) ， 功一 1 ，A
3、c 七 i n 的免疫组化结果经统计分析表明与原位R P E C 。 之间的表达无显著差异 ( 2 0 一 1 : ! t! “ 2 . 0 5 ， P 00 5 ; A c t i n : I t = 2 . 1 4， P 00 5 ) 。结论C F D A 一 S E 是一 种快捷、 稳定、 安全的活体细胞染料， 可作为理想的 标记物应用于R P E C s 移植中。哈尔滨医科大学硕士学位论文A b s t r a c t0 b j e c t i v e T o t e s ta n d v e r i f yt h ef e a s i b i l i t yo f a p p l i
4、 c a t 1 o no f v i t a 1d y eC F D A- S E t ol a b e 1RPEc e 1 l si nt r a n s P l a n t a t i o n.Me t ho dA l l o g e n i c P l g m e n t e d r a b b i tI O p m o l L 一 ，C F D A 一 S E f o r lR P Ec e l l sw e r el a b el e dwi t hm i n a t 3 7 ， t h e n w a s h e d a n dt r a n s p l a n t e di n
5、 t ot h es u b r e t i n a ls p a c e o ft h ef e 1 l o we y e b a 1 1 su s 1 n gv i t r e o u sb o d yr e t i n am i c r o s u r g e r y . R a b b i t sw e r ek i l l e do v e ra P e r i o d o f3 0d a y s a n d6 0d a y s ， a n di mmu n o s t a i n i n gf o rt h ee x p r e s s i o no fs t r u c t u
6、r e p r o t e i nZ O 一 l a n dc e l ls k e l e t o n p r o t e i nA c t i nw e r eP e r f o r m e d . T h e1 i g h ta n df 1 u o r e s e n tm i c r o s c o P yw e r ea P P l i c a t e dt oe x a m i n e t h es u r v i v a 1o ft h e l abe 1 e dc e 1 1 s .R e s u l t s1 nunu n o s t a i n i n g e x P e
7、 r i m e n t s s h o w e d t h a t 1 a b e 1 e d R P E c e 1 l ss u r v i v e da n dc o m P a c t e da m o n gt h eh o s tR P Ec e l 1 s， f o r m e dt l g h tj u n c t i o n sa n daP o l a r i z e d m o n o 1 a y e rw i t ht h e n a t i v e R P Ec e 1 1 s .S t a t i s t i c a la n a 1 y s i ss h o w
8、 e di th a sn os i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew h i c hR P Ec e l l si ns i t u( 2 0 一 1 : tl = 2 . 0 5，P 00 5:A c t i n :l tl = 2 . 1 4，P 0 . 0 5 ).C o n c l u s i o n T h ef l u o r e s c e n td y eC FDA 一 S Ec a nb eu s e da san e w用 a r k e ro fr a b b i t R P E c e 1 1 s i n t r a n s
9、P l a n t a t i o n o w i n g t o i t sc h a r a c t e r i s t i co fs a f t y， c o n v e n i e n c ea n dn o n t o x l t y .C D A-S E标记的兔视网膜色素土皮细胞移植及术后观察文 献 综 述视网 膜移植治疗视网膜色素变性 ( r o t i n i t i s p i g 帐n t o s a ， R p )， 年龄相关性黄斑变性 ( a g e 一 r e l a t e d mac u l a r d e g e n e r a t i o n 汤M D )等
10、眼底变性疾病是可行的， 有效的 ， ， J 。 视网膜由 神经上皮层和色素上皮层组成， 其中神经上皮层起视觉作用， 色素上皮层构成血一视网膜外屏障， 吞噬光感受器的外节膜盘， 起着控制和调节神经上皮营养和代谢的作用， 当 视网 膜色素上皮细胞( retinal p i g mente p i t h e h U ocell。 ，R P E C s) 出 现异常时，不能及时吞噬视细胞不断产生和脱落的外节膜盘， 使其堆积， 视细胞因代谢障碍而发生变性及坏死， 从而引 起各种眼底病，影响视功能。视网 膜移植主要包括感光细胞移植和视网 膜色素上皮移植，后者的机制是通过植入健康RPE Cs来替代退变的即
11、E Cs以挽救被损伤的光感受器细胞， 从而减缓视功能的丧失。 现将目前关于R PEC 。 移植的研究进展及细胞标记物新型染料狡基荧光素乙酸乙酸 5 一 ( and 一 6 ) 一 c a r b o x y f l u r e s c e i n d i a c e t a t e ， 。 u c c i n i m i d y le s t e r ， C F D A 一 S E 进行综述。一、移 植( 一) 移植材料1 、供 体Go盯as等( 1 9 8 3 ) 首先报道了应用体外培养的人类R PE细胞移植到猴的B r uch膜上获得成功。 此后许多学者相继开展了大量的移植研究。 任何移植
12、研究的中心都是找出合适的供体细胞， 并对其最适条件进行探索。 目 前动物实验中常用的有视网 膜色素上皮细胞s1 及与其功能相似的 虹膜色素上皮细胞们、 具分化潜能的 胚胎干细 胞以 及施旺细胞 ( 5 o h w ann ) 弱 等， 按其植入方式又分为细胞悬液移植脚及片层移植川 。 Ar硼ant 等观察到移植的R P E 细胞悬液在视网 膜下腔形成了团块状沉积或类似正常视网膜的层状结构， 前者可能由 于供休细胞遭到了破坏或未能恢哈尔滨医科大学硕士学位论文复极性而失去了原 有的生物学特性。已 有研究表明 移植合适的细胞，生长因子，和或细胞外基质能使被损害的视网膜组织再生。如将碱性成纤维细胞生长
13、因子( b 沁F ) 基因转染至细胞中， 此细胞在胞外胶原蛋白的 成熟和细胞附着方 面都有所提高。 片层移植即把细胞在各 种基质上培养， 并被一起植入受体， 这些培养基包括晶状体前囊膜， D es傀m 姚膜， 人工生物降解聚合物膜， 羊膜等等。 羊膜是由位于间叶细胞之下来源于外胚层的单层组织构成， 在间叶细胞中包含有大量的胶原质， 它可以 促进上皮生 长， 减轻炎症反应， 抑制新生血管形成， 是片层移植的较好载体。 最新一项研究使用分散酶处理过的羊膜为基底膜培养人视网膜色素上皮即防5 细胞， 其酪氮酸相关蛋白 一 2 等的基因表达上调， 血管内 皮生长因 子， 色素上皮衍生因子明 显增高， 有
14、利于R P E 细胞的分化及上皮表型表达。片层移植能更好的保持移植物的极性及提供细胞营养的基质， 这对供体细胞的成活是很重要的，但同时也增加了发生排斥反应的可能性及移植手术的难度。此外， 在移植中供体组织的 年龄是很重要的。 B 他I t 加等阅 通过衰老R 陀中脂褐素， 黑色素的构成， 光感受器累积的处理等方面的 变化推断出 虽然来自 成熟供体的细胞也可以使用， 但一般来说， 未成熟的细胞会成活得更好。 因为能 提供的供体组织通常是有限的， 所以 不同的 保存细胞的方法正在被开发， 细胞可以 放在 O p t i 、1 保存液即 或者低温贮藏一段有限 的时间直到移植手术。 随着分 子生物学的
15、发展，新收获的砂E 细胞的初始培养还可以通过基因上的修饰来延长它们在体外的寿命及保留原有的性状， 研究结果表明hl即E 一 7和h 1 R P E-1 1 6 等细胞系更多的 保留 了 原位 R 陀的 形态和生物 特性， 更适于体内 外的 移植 研究洲。2 、受 体有许多视网膜变性的动物模型以及视网膜正常未受损和轻度受损的动物模型己 经建立。 尽管涉及基因治疗方法的试验一般都需要那些和人类疾病状况同 源的动物模型， 但那些不同源的 动物模型所作的移植实验也有着重要价值， 关键是，疾病的最初靶位点和总的病理学特征要相似。 常用的 视网 膜色素变性的动物模型有R CS大鼠， rd小鼠，轻度损伤大鼠
16、。RCS 大鼠的病变在R P E 细胞，发生了由 缺失导致的隐性突变， 从而使编码酪氨酸激酶受体的基因受到千扰， 结果， 视网 膜色CFD A- sE标 记 的 兔 视 网 啤 鱼 幸 坐丝些堕到近些鼓一一一一一一一 素上皮细胞不能够有效吞噬脱落的视杆细胞外节部分， 而最终导致光感受器细胞的死亡和失明。这个模型所揭示的是通过重新植入正常R PE细胞可以保护感光细胞使其不再发生变性， 更多的被用作 A M D 的动物模型; 而rd小鼠 通常被用作RP的动物模型，在rd小鼠中光转换相关蛋白c GMP 一 磷酸二酷酶的亚单位的编码基因有缺陷， 导致大量未成形的杆细胞的快速丢失， 这与RP的病理过程是相似的。 虽然通过啮齿类动物的移植研究积累了关于考察供体细胞特性和移植结果的信息， 但却由于它们的眼睛比较小，而无法设计那些在临床上有意义的手术方法，目 前，一些较大动物的与RP类似的营养不良已 被证实， 如A b y s s inian 猫【11) 有原发性光感受器缺陷， B riard 狗 lz R P E 65基因有缺陷，但这些动
