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1、At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o r t h ed e g r e eo fM a s t e rE f f e c t so fc e l e c o x i bo np e r i t o n e a ll y m p h a n g i o g e n e s i sa n dp e r i t o n e u mf u n c t i o ni 。nu r e m i cp e r i t o n e a ld i a l y s i sr a t s。B yY u n f e
2、 n gJ i nS u p e r v i s o r ：P r o f Z h a n z h e n gZ h a oC l i n i c a lM e d i c i n e ( N e p h r o l o g y ) o ft h eF i r s tC l i n i c a lC o l l e g eM a y2 0 1 2原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律
3、责任由本人承担。学位论文作者：霸zf a日期：砂，二年上月多。日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：朝厶l 纠日期：少，2 ，年j 月岁。日L摘要C O
4、X 2 抑制剂( 塞来昔布) 对尿毒症腹膜透析大鼠淋巴管形成及腹膜功能的影响硕士研究生靳云凤导师赵占正郑州大学第一附属医院肾脏内科河南郑州4 5 0 0 5 2摘要背景和目的腹膜透析( p e r i t o n e a ld i a l y s i s ，P D ) 因其具有居家操作方便、血源性疾病感染性小、花费少、心血管事件发生率较低、保存患者尿量、保护残余肾功能等优点成为尿毒症患者的首选治疗方法，但随着透析时间的延长，患者的腹膜功能将逐渐丧失，超滤量将逐渐减少，直至超滤衰竭( u l t r a f i l t r a t i o nf a i l u r e ，U F F ) 的发生。
5、腹膜血管表面积的增大及问质淋巴系统回吸收增多是超滤衰竭发生的主要原因之一。新生血管( a n g i o g e n e s i s ) 致超滤衰竭在动物实验及临床研究中均已得到证实，并有广泛研究；但是淋巴管的形成( 1 y m p h a n g i o g e n e s i s ) 对超滤衰竭的影响研究因缺乏特异性的标志物而相对滞后。随着近年一些淋巴管特异标记物的发现，推动了淋巴管新生的研究，目前其研究地位已等同于新生血管的研究。环氧化酶一2 ( C O X 2 ) 是花生四烯酸转化为前列腺素过程中的重要限速酶。近年来大量研究表明，C O X - 2 是参与血管新生的重要因子之一，其在静
6、息状态下不表达或很少表达，但是在一些刺激因素如细胞因子、生长因子及肿瘤刺激因子等影响下其表达会明显升高。高表达C O X 2 可以通过其产物前列腺素E 2 ( PG E 2 ) 与E P l 结合，从而进一步激活H e r - 2 n e u 蛋白的酪氨酸激酶，引起V E G F -C 的表达上调；采用基因沉默的方法，使C O X - 2 的基因表达沉默，可以看到摘要V E G F C 的显著下调，说明在V E G F C 的合成过程中，C O X 2 起到了重要的调节作用。V E G F C 是机体重要的淋巴因子之一，其功能因结合受体的不同而有交叉。V E G F C 在体内通过与V E G
7、 F R - 2 结合诱导血管内皮细胞的增生而引起血管生成作用，且较V E G F 作用持久；同时V E G F C 与V E G F R 3 的高亲和力作用，具有强大的淋巴管生成作用，使V E G F C 的促淋巴管生成作用成为主导，此已成为现在研究的热点。L Y V E 1 ( 1 y m p h a t i cv e s s e le n d o t h e l i a lh y a l u r o n a nr e c e p t o r ) 1 1 淋巴管内皮细胞透明质酸受体，由于特异性好，可准确区分毛细淋巴管与毛细血管，是比较可靠的淋巴管内皮细胞标志物。目前有研究证实在多种肿瘤组织
8、中C O X 2 、V EG F C 表达与微淋巴管的形成有关，且二者呈正相关。应用C O X 2 选择性抑制剂却可以抑制P G E 2 、P G l 2 及V E G F Cm R N A 及蛋白水平的表达。尿毒症腹膜透析患者，因腹膜腔长期接触非生物相容性腹透液，致体内新生血管的生成及腹膜间质淋巴回吸收系统增加与肿瘤的发生具有相似的生理病理过程，所以C O X -2 与V E G F C 二者在长期腹膜透析患者中也可能有一定的表达，并存在一定的相关性。所以我们构建尿毒症腹膜透析大鼠模型，以L Y V E 1 作为淋巴管的标记物，检测C O X - 2 、V E G F C 的表达及应用C O
9、 X - 2 抑制剂( 塞来昔布) 后对其表达和对淋巴管生成以及腹膜功能的影响。方法清洁级S D 大鼠均为雄性，共4 8 只，体质量为1 8 0 2 0 0 9 。共分为5 组：A ：正常对照组( n - 8 只) ，B ：假手术组( n _ 8 只) ，C ：尿毒症非腹透组( n - 8 只) ，D ：4 2 5 腹膜透析组( P D 组，n = 1 6 只) ，其中D 组大鼠各选取8 只分为D I ( P D2 周)和D 2 ( P D4 周) 组。E ：P D + 塞来昔布干预组( n _ 8 只) 。A 组大鼠不进行任何处理；B 组大鼠行双侧肾包膜的剔除术；C 组行5 6 肾脏切除术；
10、D 、E 组按3 r n l 1 0 0 9B W 从大鼠颈部腹透管注入4 2 5 腹透液，保留时间2 小时，规律腹膜透析；E 组在规律腹透期间，每日每只按2 0 m g k gB W 塞来昔布溶液灌胃，连续给药，直至腹透第2 8 天结束。1 ) 采用免疫组织化学方法检测大鼠腹膜组织中C O X 2 、V E G F C 蛋白表达及淋巴管密度( L V D ) 变化，并进行相关性分析。2 )逆转录聚合酶链反应( R T - P C R ) 法检测各组腹膜组织C o X 2 、V E G F C 、L Y V E摘要1m R N A 表达量，并分析各组间统计学差异。3 ) 正常组、P D2 周、
11、P D4 周组以及E 组大鼠处死前行腹膜平衡实验( P E T ) ，准确计算净超滤量( U F ) 、腹透液4h 与0h 糖比值( D D 0 ) ；采用H E 和M a s s o n 染色，光镜下观察不同透析时间壁层腹膜组织结构形态变化，分析塞来昔布应用对腹膜功能的影响。结果1 与正常组相比，假手术组大鼠腹膜组织C O X - 2 和V E G F Cm R N A 、蛋白表达差异无统计学意义门口 0 0 5 ) ，尿毒症非腹透组、4 2 5 腹透组C O X 一2 和V EG F Cm R N A 、蛋白表达量均明显升高，差异有统计意义( 均P O 0 5 ) ，尿毒症非腹透组、4 2
12、 5 腹透组L V D 值明显升高，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ，说明左肾2 3 切除符合要求。此实验过程中因肾切除部位止血不当，导致1 只大鼠死亡，原因可能为失血性休克。第二步：右肾全切( 左肾2 3 切除一周后) ，此过程手术顺利，无一只大鼠死亡。假手术组行双肾包膜剥除术，未出现不良反应。6 周后，检测各组大鼠肾功能( 血清尿素氮和血清肌酐值) 。若大鼠血清肌酐值是正常大鼠血清肌酐值得2 3 倍，则认为造模成功 r l 。实验中有1 只大鼠肌酐水平未达上述标准，退出实验。与正常组大鼠相比，假手术组肾功能的变化差异无统计意义( 胗O 0 5 ) ，与正常组及假手术组相比，尿毒症组
13、大鼠血清尿素氮和血清肌酐水平则明显升高，差异有显著统计学意义( P o 0 5 。与正常组及假手术相比较，巾 O 0 5 ) ；与正常组大鼠相比，尿毒症组大鼠体重则明显下降，差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ，6 p 0 0 5 ) ，尿毒症非腹透组及4 2 5 腹透组C O X 2 、V E G F C 、L Y V E 1 m R N A 的基因表达明显高于正常组，其差异有统计学意义( 尸 o 0 5 ；与正常组及假手术组相比，b p 0 0 5 ) 。塞来昔布干预组与正常组相比，虽然可见胶原沉积、腹膜厚度的增加，但与P D4 周模型组相比，胶原沉积、腹膜厚度明显减轻，其差异具有显著统计
14、学意义( 尸 - - j 和生活中的帮助；同时还要感谢同门赵志红，在这三年中与我共同携手走过，以及师妹高欢欢、段喜梅、马爽，师弟黄忠对自己的帮助。再者，衷心感谢在我学 - - j 期间给予我帮助的人们，首先感谢邢国兰老师在我们实验方面的帮助，感谢肾脏病理室权松霞，周雅丽、卢敏老师对自己的指导和帮助，感谢肾病实验室王春燕老师，感谢风湿科主任刘升云老师对自己的帮助和关心，感谢郭佳师姐、梁艳师姐，感谢同学苏晨浩、张茜、易润，王鑫对自己的帮助，正是有了你们的无私帮助，我才能顺利完成课题，谢谢你们!衷心的感谢百忙之中参加我的论文答辩的各位专家老师和评阅论文的各位教授!最后，我要感谢我的亲人们，是你们给了我无私的爱和有力的支持，你们是我最温暖的港湾，最坚强的后盾。
