《垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中山大学硕士学位论文垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究姓名：徐伟光申请学位级别：硕士专业：外科学指导教师：王海军20060501垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究中山大学硕士学位论文垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究硕士研究生：徐伟光导师：王海军教授中山大学附属第一医院神经外科摘要垂体腺瘤是颅内常见肿瘤，约占1 2 1 5 ，半数病例具有侵袭性。侵袭性垂体腺瘤多为大腺瘤，具有向周围正常结构如海绵窦侵袭性生长的特点，导致其全切率低、复发率高，一直是神经外科的治疗难点。要探索一种治疗侵袭性垂体瘤的有效途径就需要更深入的研究侵袭性垂体瘤的发病机理及相关生物学
2、特性。国内外学者通过临床病理及分子生物学技术希望找出具有高残留率、高复发风险的侵袭性垂体瘤的生物学标志，为进一步研究如何根治侵袭性垂体瘤创造理论基础。近年来垂体瘤侵袭性的研究主要集中在肿瘤细胞本身异常方面，如：细胞中的染色体异常，相关的癌基因、抑癌基因等，拟从肿瘤细胞内部找出侵袭标记，但到目前为止，还没有可靠的标记物能预测肿瘤的生物学行为。我们知道，肿瘤的形成、生长、侵袭等亦受细胞外因素的影响，血管形成与肿瘤侵袭都需要细胞外基质成份的降解和细胞移动，在垂体腺瘤侵袭性机制的研究中对肿瘤间质成分研究甚少。我们从垂体腺瘤的细胞培养入手，以侵袭性垂体腺瘤的间质成分为重点，探讨其侵袭性机制。第一部分人垂
3、体腺瘤细胞原代培养的纯化及其激素的表达与分泌的研究目的探讨原代培养垂体腺瘤的细胞纯化方法及其激素表达与分泌的特点。方法采用三种原代培养方法对垂体腺瘤细胞进行培养，方法I 为目前常用的垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究中山大学硕士学位论文垂体瘤细胞培养方法；方法I I 结合使用右旋颉氨酸( D - v a l i n e ) 替代左旋颉氨酸( 叫a l i n e ) 的D M E M 刃_ v a l i n e 培养液；方法I I I 采用反复贴壁法结合D M E M ) - v a l i n e培养液培养。观察其细胞形态变化和生长特征，放射免疫法测定不同培养时间培养液中相应
4、激素的水平。免疫组织化学染色法检测培养细胞生长激素( g r o w t hh o r m o n e ，G H ) 、泌乳素( p r o l a c t i n ，P R L ) 的表达。结果3 种方法均能成功培养出垂体腺瘤细胞，呈圆形或椭圆形，其纯度随培养时间的延长逐渐下降，培养第2 0 d 其平均纯度分别为4 0 ，4 6 ，9 6 。方法I I I 明显高于方法I 和方法I I ，差异具有显著性意义( 尸 O 0 5 ) T h ep o s i t i v ee x p r e s s i o no fG Ho rP R Li nt h ep i t u i t a r ya d
5、e n o m ac e l l sw a si na c c o r d a n c ew i t ht h ec l i n i c a lc l a s s i f i c a t i o no ft h ep i t u i t a r ya d e n o m a T h ee x p r e s s i o no fc o l l a g e n1w a sp o s i t i v ei nt h ef i b r o b l a s t C o n c l u s i o nT h ep u r i t yo fp i t u i t a r ya d e n o m ac e
6、 l lw a so v e r9 5 b ym e t h o dI I I T h ee x p r e s s i o no fG Ho rP R Lw a sp o s i t i v ei nt h ep u r i f i e dp i t u i t a r ya d e n o m ac e l l sa n dt h e s ec e l l sh a v es a t i s f a c t o r yh o r m o n es e c r e t i o nf u n c t i o n ，w h i c hp r o v i d ee x p e r i m e n
7、tf o u n d a t i o nf o rs t u d y i n gt h ep a t h o g e n e s i s ，c h e m i c a lt h e r a p y , a n de x t r a c r a n i a lc e l lt r a n s p l a n t a t i o n ，a n dS Oo n 垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究中山大学硕士学位论文P a r tt w o ：C o m p a r i s o no fg r o w t ha n da p o p t o s i so ff i b r o b l a
8、 s t sd e r i v e df r o mp i t u i t a r ya d e n o m aw i t ha n dw i t h o u ti n v a s i o no b j e c t i v eT oa n a l y z ea n dc o m p a r et h ed i f f e r e n c eo fg r o w t ha n da p o p t o s i so ft h ef i b r o b l a s t sd e r i v e df r o mp i t u i t a r ya d e n o m a 、析t l la n dw
9、 i t h o u ti n v a s i o n T os t u d yt h er o l eo ff i b r o b a l s t si nt h ei n v a s i v eg r o w t ho ft h ep i t u i t a r ya d e n o m a M e t h o d sT e ni n v a s i v ep i t u i t a r ya d e n o m at i s s u ea n dt e nn o n i n v a s i v ep i t u i t a r ya d e n o m at i s s u ew e r
10、 ec u l t u r e d T oo b s e r v et h ec h a n g e si n c e l lm o r p h o l o g ya n dc e l lg r o w t hv e l o c i t y ，I m m u n o h i s t o c h e m i c a lt e c h n i q u ew a su s e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no fc o l l a g e nIa n dv i m e n t i n o ft h ef i b r o b l a s t s T oc
11、 o m p a r et h ed i f f e r e n c eo fD N Ac o n s t r u c t i v em e t a b o l i s m ，a n dt od e t e c tt h ea p o p t o s i so ft h ef i b r o b l a s t sw i t h f l o wc y t o m e t e r R e s u l t sI nt h ep r i m a r yc e l lc u l t u r eo ft h ei n v a s i v ep i t u i t a r ya d e n o m a ，
12、t h ef i b r o b l a s t sa p p e a r e da t1 - 2 d ，c o v e r e dt h eb o t t o mo ft h ec u l t u r ef l a s ka t8 d T h ef i b r o b l a s t sa p p e a r e da f t e r10d a y Sc u l t u r e ，c o v e r e dt h eb o t t o mo ft h ec u l t u r ef l a s ka f t e r1m o n t hi nt h ep r i m a r yc e l lc
13、 u l t u r eo ft h ei n v a s i v ep i t u i t a r ya d e n o m a c o l l a g e nIf i n dv i m e n t i nw e r ep o s i t i v ee x p r e s s i o ni nt h ef i b r o b l a s t s T h eD N Ac o n s t r u c t i v em e t a b o l i s mo ft h ef i b r o b l a s t sd e r i v e df r o mi n v a s i v ep i t u i
14、 t a r ya d e n o m aw a sh i g h e rt h a nt h a to ft h ef i b r o b l a s t si nt h ep i t u i t a r ya d e n o m aw i t h o u ti n v a s i o n ( t = 2 8 2 8 ，P hhopo=【oo一_ohpoool；6一厂1筐oo旨j_oAhopo铀oo垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究中山大学硕士学位论文P R L 表达阳性( 图4 ，5 ) ，而成纤维细胞绝大多数呈I 型胶原表达阳性( 图6 ) 。3种方法培养的腺瘤细胞的纯度变
15、化如下图所示：方法I I I 在培养第2 0 天纯度仍可达9 5 以上。一变互王王圭一 卜垂 L 。一r一一壁、一、啊- - - w - - m e t h o d I 薯一m e t h o d1 Im e t h o dI51 01 55 02 5t d腺瘤细胞平均纯度随培养时间的变化T h ea v e r a g ep u r i t yc u r v e so fp i t u i t a r ya d e n o m ac e l l sa l o n gt h ed a y so fc u l t u r e3 讨论3 1 垂体瘤组织标本的取材方法垂体瘤组织一般都经神经外科手术切
16、除的肿瘤获得。手术切除肿瘤的方法对培养结果有直接的影响。如用钳刮术，瘤细胞数量获得较少，但标本中混杂血细胞少；用吸引法收集的瘤细胞数量较多，但易混杂大量的血细胞，且组织损伤大。常规手术( 尤其是对微腺瘤的手术) 易夹带有周围正常垂体组织，因此有些研究者采用植入探针吸取垂体腺瘤中心部位的组织，以避免正常组织被夹带。本实验所用标本均由同一神经外科医师采用H a r d y 氏改良经口鼻蝶窦入路完成手术，术中显微镜下打开鞍底硬脑膜后，不用电凝等止血措施，先取出肿瘤标本，取材后立即无菌操作下放入含培养液的容器中送往实验室进行培养。3 2 培养方法的选择经手术切除的垂体腺瘤可迅速作培养，也可在4 。C 条件下将组织块保存2 4 小时，8加0垂体腺瘤细胞原代培养及成纤维细胞与侵袭性关系研究中山大学硕士学位论文然后再予培养。体外培养的方式可分为组织块培养法和分散细胞培养法。前者在7 0年代研究较多，方法是将垂体瘤组织机械剪碎成l m m 3 大小的碎块，然后植入培养器皿中，加培养液温育。这种培
