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1、黑龙江中医药大学博士学位论文健骨胶囊对兔股骨头坏死修复作用的实验研究姓名：王淑梅申请学位级别：博士专业：中西医结合临床指导教师：董清平20060501中文摘要目的：本课题设计动物实验的方法以探求健骨胶囊对股骨头坏死修复作用的研究，以便寻找一种能真正影响疾病过程方式来防治股骨头坏死，为临床有效地治疗本病堤供理论依据。方法：l 、健骨胶囊毒理学和药理学的实验研究。2 、动物造模的研究：取健康成年家兔6 0 只后腿，右后腿做液氮冷冻股骨头坏死模型，造模成功后随机分为A 、B 、C 、D 三组。A 纽为中药健骨胶囊组；B 组为仙灵骨葆胶囊阳性对照组；c 组为模型对照组；左后腿作正常对照组D 。结果：经
2、免疫组化和原位杂交法测量各组数据经统计学分析，健骨胶囊组与阳性对照组相比较有显著的差异( P O 0 5 )4 、对红细胞、血红蛋白、自细胞计数及白细胞分类的影响，均采用常规方法进行测试，结果见表3 。表3 健骨胶囊对大鼠血常规的影响( 茸S D ) n = 2 0健骨胶囊连续用药9 0 天，各用药组与空白对照组比较：R B C 、W B C 、H b 、中心粒细胞、淋巴细胞等各项测试指标问差异无显著性意义( p 0 0 5 ) ，表明该药对由常规无明显影响。5 、对肝、肾功能的影响健骨胶囊连续用药9 0 天，各用药组与空白对照组比较：S G P T 、B u N 、总蛋白、白蛋白组间差异无显
3、著意义( p 0 0 5 ) ，表明该药对肝、肾功能无明显影响。( 见表4 )表4 健骨胶囊对大鼠肝、肾功能的影响( 覃s D ) n = 2 06 、给药9 0 天后处死动物，首先肉眼观察心、肝、脾、肺、肾未见明显改变，然后组织包埋，常规制片、染色、在光学显微镜下观察，各脏器未见明显病理改变。( 四) 实验小结连续用药9 0 天，健骨胶囊对大鼠体重，主要脏器重量指数、血常规、肝肾功能及重要脏器均无毒性反应，表明该药无毒性，临床使用无毒剐作用。二液氮冷冻股骨头坏死动物模型的制备与观察( 一) 主要仪器1 、手术设备：哈尔滨市骨伤科医院提供；2 、石蜡切片机( L e i c a 德国)3 、光
4、学显微镜照相系统( L e i c a 德国)4 、骨密度测量仪：美国产N O R L A N D X R 3 6 型双能骨密度全身测量仪。5 、D R 直接数字成像系统：G O L DS T A N D A 一1 7 美国泛太平洋企业公司。( 二) 材料1 、新西兰大白兔6 0 只，体重2 、5 3 、5 k g ，雌雄各半。由黑龙江中医药大学实验动物中心提供；2 、硫喷妥钠：上海新业药业有限公司，沪卫药准字( 1 9 9 5 ) 第0 0 8 0 0 4批号0 0 1 0 0 1 。3 、生理盐水：哈药集团制药六厂生产，批号0 5 0 4 2 9 、1 1 24 、健骨胶囊：黑龙江中医药大
5、学附属医院制剂室提供；5 、仙J 灵骨葆胶囊：贵州同济堂制药有限公司生产，批准文号：国药准字Z 2 0 0 2 5 3 3 7 。( 三) 造模方法及分组采用新西兰大白兔，造摸前均左侧耳静脉采血。参照T a k a o k a ( 2 7 )的造摸方法，采用2 硫喷妥钠经兔耳静脉麻醉，：制量按2 5 m g k g - i , J 算_ 哿兔俯卧置于动物手术台上，按严格无菌操作原则进行手术，剪毛后暴露右侧后肢，碘伏消毒后作髋部外侧切口，逐层切开，暴露股骨头，用无菌纱布包绕股骨头周围以保护股骨头以外的组织。将股骨头用蘸满液氮的纱布敷贴2 分钟，然后无菌生理盐水敷料覆盖股骨头至常温后回纳股骨头，逐
6、层缝合，单笼饲养。麻醉复苏后，各组动物状态良好。术后肌注青霉素钠4 0 万U ，连续3 天，防止感染。术后各组家兔造模后3 天均左侧耳静脉采血。造模成功后分三组。 健骨胶囊组：B I I l 灵骨葆胶囊阳性对照组；C空白对照组。所有动物均在左侧手术，右侧作为自身对照。术后均以普通饲料单笼饲养，食水不限。( 四) 统计学处理实验结果均用X S 表示，采用S P S S l l 0 统计软件对实验数据进行单因素方差分析和显著性检验，以p O 0 5 *塞! 圣堑鱼壁垂婴塑变垡垒圭丑婴坐Q ! 坐 5 N11周P表9 各纽筇1 1 周向液流变学的变化( x s )指标正常组空r 旧【阳性对照组健骨胶
7、囊组全血低切黏7 2 6 0 6 493 5 4 - 0 8 58 9 4 _ + 0 7 88 4 9 4 _ 0 6 1全血商切黏4 0 1 0 1 44 9 4 0 4 4 *5 0 4 4 - 0 4 7 *4 ，3 6 0 2 3 *毛细管黏度1 3 4 _ + 0 0 61 5 7 4 - 00 7 1 5 5 O 0 8 *! 4 3 4 - 0 0 5 血沉方程( K 值) 3 - 3 4 _ 4 6 34 3 1 3 3 8 9 * 4 4 3 1 3 7 4 *3 1 2 5 - + 3 5 6 红细胞变形指数( T K ) 0 8 4 - + 0 0 5O 9 0 O 0
8、 7O 9 2 4 - 0 0 6O 8 9 - + 0 0 6凝血因子I ( V , p g L i ) 1 2 3 士O 1 24 0 0 士O 2 4 *3 9 5 4 - 0 3 1 2 1 4 - + 0 2 3 料表1 0 各组空骨陷窝率比较( i s ) 组别正鲎组空白纽田性盈照组地昼：脏囊组数值1 1 1 62 7 _ + 2 51 9 4 _ 2 11 5 1 9 + 从以上表格中我们可以看出；治疗组与对照组相比有差异( p O 0 5 ) ；C 组健侧与忠侧相比有明显差异( P O 0 1 ) ：A 组患侧与C 组患侧相比有非常明显的差异( P 0 01 ) ；B 组忠侧与
9、C 组患侧相比有差异( P O 0 5 ) ；A 组患侧与B 组息侧相比有荠9 8 1 “ ( P 0 0 5 ) ；说明健骨胶囊可以增进骨密度。有利于股骨头的恢复。黑龙江中医药大学博士学位论文 曼蔓! ! ! 篁! ! 曼! ! 罡寰舅舅曼曼! 曼留粤曼毫寰巴曼璺曼皇蹬曼塑璺鼍孽曼曼璺璺蔓! 曼曼鼍孽! ! 曼! ! 璺虫! 旦! 曼璺曼竖曼曼墅曼粤曼蔓曼! ! ! 苎三健骨胶囊对股骨头修复过程中I 型胶原蛋白的影响 ( 一) 实验材料l 、实验试剂I 型原位杂交试剂盒：C o l l a g e nT y p eI ( 产地：博士伦生物工程有限公司)I 型胶原免疫组化试剂盒：二步法免疫组化
10、检测试剂P V - 6 0 011 6 0 0 2P o w e r V i s i o n T M T w o S t e pH i s t o s t a i n l n gR e a g e n t ( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 。I 型胶原寡核苷酸探针采用A l e s s i o 等报道的序列f 5 7 1 5 ， G A T T G T G G G A T G T C T G T C T T _ 3 ，经地高辛标记。兔I g G 抗体一H R P 多聚体：( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 。D A B 显色剂：( 北京中杉金桥生物技术有限公司) 。2 、实验仪器及设备：由黑
11、龙江中医药大学第一附属医院临床实验中心提供。( 二) 实验方法1 、动物实验分组动物造模成功后按随机分组的原则将6 0 只新西兰白兔分为三组，每组2 0 只。A 组：健骨胶囊组：B 组：仙灵骨葆胶囊组；C 组：模型对照组：2 、处理措施A 组：造模后灌胃给药，每日一次。每次用健骨胶囊1 、5 9 ，相当于生药7 、5 9 ，用蒸馏水调成混悬液2 0 m l 。B 组：造模后灌胃给药，每日一次。每次用仙灵骨葆胶囊1 、5 ，相当于生药7 、5 9 ，用蒸馏水调成混悬液2 0 m l 。C 组：造模后生理盐水2 0 m l 灌胃，每日一次。3 、取材与标本制作所有家兔造模前及造模后每周固定时间应用
12、婴儿秤测空腹体重，并观察家兔的精神状况，活动情况，毛发光泽，食欲及大便性状等。取材后做骨密度和D R 拍片并通过取材前准备一取材一固黑龙江中医药大学博士学位论文定一载玻片的准备一标本固定后充分脱钙一经梯度酒精( 含D E P C ) 和正丁醇脱水一脱水后用二甲苯透明石蜡包埋一制作切片。4 、组织病理学观察H E 染色后光学显微镜观察，将已制好的：石蜡切片充分( 6 0 摄氏度) 烘烤6 h ，常规H E 染色，在光镜下观察，并进行显微摄影。5 、免疫组化P o w e r V is i o n T M T 免疫组化检测试剂利用某些单体有机小分子将兔的免疫球蛋白与过氧化物酶联结成多聚体形式，使每
13、一个抗体分子与多个酶分子相连，替代传统方式中的二抗和三抗，直接放大抗原抗体结合的信号，可以将位于人和动物的组织切片和细胞涂片上的抗原定位。与传统的S P 三步法相比，此试剂盒具有简单、快速、敏感等特点，因为系统中不再使用生物素，所以避免了由于内源性生物素所造成的背景染色。6 、免疫染色步骤：( 所有的步骤均需在温室条件下完成)( 1 ) 脱蜡、水化组织切片。( 2 ) 过氧化氢去离子水孵育5 - 1 0 分钟，阻断内源性过氧化物酶。( 3 ) 根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。( 4 ) 滴加兔来源的一抗，3 7 度孵育卜2 小时或4 度冰箱过夜，P B S或T B S 冲洗，
14、2 分钟木3 次。( 5 ) 滴加兔I g G 抗体一H R P 多聚体，室温或3 7 度符育2 0 一3 0 分钟，P B S 或T B S 冲洗，2 分钟术3 次。( 6 ) 选用D A B 或A E C 显色。( 7 ) 蒸馏水或自来水充分冲洗。( 8 ) 如果需要，可进行复染、脱水、透明。( 9 ) 选择适当的封片剂进行封片。7 、原位杂交预实验主要目的是找到I 型胶原探针的适当工作浓度及胃酶的消化时间。I 型胶原选2 0 张4 周模型组切片做预实验；具体的实验步骤如下：经烘片；脱蜡至无水；消除内源性过氧化氢酶黑龙讧中医药大学博士学位论文的活性；采用胃酶消化的方法暴露m R N A 核
15、酸片段，消化时间分别是5 m i n 、1 0 m i n 、2 0 m i n 、3 0 m i n ，每时问组5 张切片，消化后用原位杂交专用P B S ( 含D E P C ) 冲洗；后固定；预杂交；杂交时按l ：l ：1 ：2 ；1 ：5 ；1 ：1 0 的比例用探针稀释液稀释探针，对不同胃酶消化时间组的每一张切片滴加2 0 u I 的不同浓度的杂交液( 另外4 张不同胃酶消化时间切片原位杂交专用P B S 代替探针做阴性对照恒温4 0 摄氏度过夜目的是找到合适的探针浓度) ；杂交后洗涤；滴加封闭液，生物素化鼠抗地高辛及S A B C ；染色及封片；光镜观察，并进行显微摄影预实验结果显
16、示I 型胶原探针的适当工作浓度为1 ：2 ：胃酶适宜的消化时问为2 0 r a i n 。预实验后，I 型胶原按1 ：2 的探针稀释浓度，胃酶消化时间2 0 m i n 分别对各组的标本进行实验。再进行光镜下观察，显微摄影对其结果采用方差分析检验。8 、对照设立原位杂交均设空白对照，平行操作，标记探针均用P B S 缓冲液替代。三、实验结果1 、原位杂交判定标准：每张切片随机选取】O 个高倍视野，以阳性染色强度和阳性细胞数两个方面进行判断。阳性染色强度：阴性：0 分，淡染：1 分，染色清晰：2 分，染色强度：3 分。阳性细胞数：小于1 0 计0 分，小于2 5 计1 分，小于5 0 计2 分，大于5 0 计3 分。两项指标相加分数作为最后判定分数其结果采用方差分析检验，如表1 2 ：表1 2 健骨灵胶囊对I 型胶原蛋白转录水平的影响(
