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1、沮州医学院硕士学位论文前言糖尿病足是糖尿病患者致死致残的严重并发症之一据报道，全球1 5 亿糖尿病患者中1 5 将在其生活的某一时间发生足溃疡或坏疽。因糖尿病足造成的截肢者是非糖尿病患者的1 5 倍糖尿病足的病交基础是糖尿病病人的两大慢性并发症，即血管病变和神经病变。已有研究表明，血管内皮功能紊乱可导致血管收缩异常、张力增加，血栓形成，并通过许多生物活性物质的分泌，促进动脉粥样硬化形成，与糖尿病大血管病变密切相关而糖尿病微血管病变、神经低灌注则是塘尿病神经病变病因学的一个重要因素粒细胞集落刺激因子( g r a n u l o c y t ec o l o n ys t i m u l a t
2、 i n gf a c t o rG C S F ) 是由单核一巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞合成的含1 7 4 氨基酸残基的糖蛋白，分子量为1 9 6 K D 。G - C S F 能刺激骨髓粒细胞前体，使之分化增殖为成熟粒细胞的集落。G - C S F 还能作用于完全成熟的终末粒细胞，提高中性粒细胞的吞噬能力，促进超氧化物的产生临床上G - C S F 常用于各种中性粒细胞减少症的治疗近年来临床研究证实G C s F 有助于糖屎病足患者新生血管的形成及创口的愈合。H u a n gP 等用G - C S F 动员的外周胤单个核细胞移植，静息痛明显缓解，随访结束时溃疡愈合数目与对照组相比
3、显著提高，且移植组无下肢截肢发生，1 2周静息A B I 的增高明显高于对照组，数字减影血管造影提示移植后新血管的形成增高，随访结束时移植组侧枝循环的形成高于对照组1 1 1 不仅如此，实验研究有发现后肢缺血的糖尿病鼠单用G - C S F 治疗3 天，缺血后肢骨胳肌的血管数量显著增加翻。G - C S F 独立的促进血管新生作用，其机制尚不清楚。G - C S F 刺激骨髓细胞分化为血管内皮细胞，从而增加内皮细胞的数量。同时G - C S F 本身也有可能通过影响细胞因子的表达对机体产生影响，现有研究表明G - C S F 能促进骨髓单核细胞系，特别是中性粒细胞分泌并释放血管内皮生长因子(
4、V E G F ) ，通过血管内皮生长因子受体l ( V E G F R l ) 信号传导，提高后肢缺血模型的血管生成【3 l 。G - C S F 对外周血干细胞动员的健康供体志愿者和血液病患者上，结果显示G - C S F 动员后其外周血黏附分子的水平均有增高【t ：3 1 ，提示G - C S F 对血管内皮有激活作用。故有学者提出G - C S F 用于非粒细胞缺乏时的治疗，可能会带来负面效应，如粘附分子的高表达可增强白细胞的黏附，造成相应毛细血管的阻塞和内皮细胞损伤，并可能造成糖尿病患者增殖性视网膜病变的加重。糖尿病足病患者其体内细胞问粘附分子( I C A M - 1 ) 和E 选
5、择素( E - s e l e c C t i n ) 本身处于高水平状态，在应用G - C S F 治疗后，是否会对其I C A M l 和E - s e l e c t i n的表达产生影响则未见报道。本研究通过对糖尿病足患者用小剂量短程的G - C S F ( 1 5 0 u g3 天) ，动态观察其血清白细胞、可溶性I C A M - I ( sI C A M - 1 ) 和可溶性E - s e l e c t i n ( s E - s e l e c t i n ) 的5沮卅l 医学院硕士学位论文水平变化，探讨G - C S F 辅助治疗糖尿病足时对黏附分子的影响及其可能的机制资料
6、与方法一资料l 对象2 7 例研究对象均来自温州医学院附属第一医院内分泌科住院部的糖尿病足患者，分为G - C S F 治疗组( 治疗组) 和常规治疗组( 对照组) 。病例纳入标准：( 1 ) 糖尿病诊断时年龄在4 0 以上；( 2 ) 有双下肢麻木、疼痛、发凉、跛行；( 3 ) 溃疡面积中等：0 5 c m - 3 c m 左右。W a g n e r 分级为2 3 级。( 4 ) 彩色多普勒检查示下肢动脉有狭窄、内膜增厚、粗糙，血栓形成或动脉粥样斑块；( 5 ) 未服用噻唑烷二酮类药物及他定类药物，未服用抗氧化剂8 谎辛酸、维生素E 。入选病例需排除以下情况：血液病、结缔组织疾病、大量蛋白
7、尿、肿瘤、慢性肝病、慢性肠功能紊乱、肝肾功能衰竭、心力衰竭、急性脑梗死及酮症酸中毒等；使用免疫抑制剂者；甲亢、皮质醇增多症、肢端肥大症等内分泌疾病；合并使用降脂药物，近期使用细胞因子治疗l 合并糖尿病增殖期视网膜病变。2 实验试剂：2 1 可溶性选择素E 试剂盒( h u m m lsE - s e l e c t i nE U S A )( 由A u s t r i a 的B e n d e rM e d s y t e m sG m b H 提供)酶标板浓缩H R P - 结合抗可溶性选择素E 单克隆的抗体( 1 0 0 x ) 1 0 0 n g m l 可溶性选择素E 标准品，低压冻干
8、低压冻干对照管浓缩洗涤液样品稀释液浓缩缓冲测定液显色液终止液( 1M 磷酸)兰染液，绿染液，酶标板覆盖物去离子水2 2 可溶性细胞间黏附分子一l 试剂盒( 购自华美生物有限公司，进口分装)6量州医学院颈士学位论文酶标板样品稀释液 n m 显色液终止液A n t i - S i c a m 1B i o t i n标准品H R P浓缩洗涤液( 2 0 x )表I2 组病例一般临床资料比较变羹对照组( n - 1 2 )治疗组( 萨1 5 )计量资料以均数标准差( x s ) 表示，用t 检验，P1 1 o 0 5 计数资料用一检验，P 值 0 0 5 3 实验仪器及设备zM i c r o w
9、e l ls t r i p 删盯c a p a b l eo f 豫I d i 吨a t4 5 0 n m 酶标仪台式普通离心机( 上海安亭科学仪器厂)一2 0 低温冰箱( 河南冰熊保鲜设备有限公司)4 试验过程7沮州医学院硬士学位论文4 1 可溶性细胞间黏附分子一l 测定取出所需的反应板。分别加入5 u l 标准品、5 u l 已稀释血清或血浆于反应板孔中，轻轻混匀1 0 秒。每孔加入2 0 0 u iB i o t i na n t isI C A M - I ，轻轻混匀3 0 秒3 7 温育3 0 分钟洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板，并去除水滴( 在厚叠吸水纸上拍干) ：这样反
10、复洗涤5 次。每孔加入2 0 0 u lH R P ，轻轻混匀1 0 秒3 7 温育3 0 分钟。洗板：甩尽板内液体，用洗涤液洗涤反应板，并去除水滴( 在厚叠吸水纸上拍干) ；这样反复洗涤5 次。每孔加入1 0 0 u lT M B 显色液，轻轻混匀l O 秒，置暗处室温温育2 0 分钟。每孔加入1 0 0 u l 终止液。轻轻混匀3 0 秒；1 5 分钟内在4 5 0 r i m 处读O D 值。4 2 可溶性选择素E 测定试剂准备除了H P , P ( 试剂C ) ，其余试剂在开始实验前应作准备。A 浓缩洗涤液浓缩洗涤液如果发生结晶，逐渐加温至完全溶解。倒出全部浓缩洗涤液5 0 m l 至
11、干净1 0 0 0 m l ( 刻度) 量筒。用去离子水加至最终刻度至1 0 0 0 m l 。轻轻混合避免起泡沫。调整最终液体P H 值至7 4 。将其倒入干净的瓶中保存在2 - 2 5 注意洗涤液只能稳定3 0 天B 缓冲测定液混匀瓶中的内容将浓缩缓冲测定液( 2 0 x ) 5 m l 加上9 5 m l 去离子水，轻柔的混匀避免其泡沫。贮存至2 _ 8 。注意缓冲测定液只能稳定3 0 天C 准备H R PI t R P 必须用缓冲测定液( 试剂B ) l ：1 0 0 稀释。在使用前装入干净的塑料试管。需要注意H P , P 应在稀释后3 0 分钟内使用。D 准备标准品加入蒸馏水至贴有
12、标准品管使得低压冻干的标准品完全溶解。标准管的标签上说明了配后的容量。轻柔的混和确保完全且均质的溶解。E 准备对照品加入2 0 0 u l 蒸馏水至低压冻干的对照品使其溶解。轻柔的混和确保完全且均质的溶解。对照范围请参照管形瓶标签。配好的对照品部分保存在2 0 避免反复的冻融。操作步骤 在使用前混匀所有的试剂，避免起泡8 标准品、空白管应双份测定。取下所需的酶标板。C 每孔用近3 0 0 u l 的洗涤液冲洗微孔板2 次，两次洗涤之间充分吸干避免表面毫温州医学院磺士学位论文有划痕。洗完后，在吸水纸上轻叩除去洗涤液洗后马上使用微孔板，不得超过1 5分钟微孔板不得变干D 加入l O O u l 样
13、品稀释液至所有的标准孔通过移入l O O u l 稀释的标准品，准备标准稀释。标准孔每孔加入1 0 0 u 1 样品稀释液双份将可溶性选择素E 标准品l O O u l加入孔A l 和A 2 ，通过吹打混匀。然后移入1 0 0 M 加入孔B l 和B 2 。注意酶标板的内面不要刮擦。这个过程重复5 次，形成2 捧标准品，浓度从5 0 - 0 8 n g m 1 最后的标准孔液体丢弃l O O u l E加入1 0 0 u l 样品稀释液双份至空白孔F加入8 0 u l 样品稀释液至所有样本孔G加入2 0 u 1 样本，并混匀。H准备H R P 。H R P 必须用缓冲测定液( 试剂B ) ls
14、1 0 0 稀释。在使用前装入干净的塑料试管。需要注意H R P 应在稀释后3 0 分钟内使用。I每孔加入5 0 u l 稀释( 1 ；1 0 0 ) H R P ，包括空白孔。J用覆盖物盖好，在室温下孵育2 小时。如有可能，在l O O r p m 的振动器上。K除去覆盖物，倒空每孔。洗板3 遍。如C 步骤。L每孔加入l O o t l l 混合的T M B 显色液。包括空白孔。M在l O O r p m 的振动器振荡后，在室温下孵育1 0 分钟。注意避光当浓度最高的标准品为深蓝色的时候，建议加入终止液。或者用酶标仪器6 2 0 n s 作为参考波长，0 D 值0 6 至O 6 6 显色反应
15、应该被终止。O每孔加入1 0 0 u l 终止液终止酶联反应。终止液快速快速均匀散布在酶标板使得酶失活的重要步骤。终止液加后立即读数。或在暗处2 8c 在1 小时内读数。P在分光光度计用4 5 0 h m 作为基础波长读取每孔的吸光率。( 6 2 0 h m 作为参考波长) 。确定样本和标准品的吸光率。二方法l 血样的采集与处理：入选病例于入院次日清晨空腹留取外周静脉血3 m l ，治疗组留取用吉粒芬后第3 、5 、l O 、1 5 、2 0 天的外周静脉血3 m l ，对照组留取治疗第2 0 天的外周静脉血3 m l 。血样留取置室温自然凝固后，以3 0 0 0 r p m m i n 离心
16、1 0 分钟，小心吸取血清约1 5 m l 于E P 管中，置- - 2 0 冰箱储存待检。2 分组方法，治疗组在常规药物治疗( 胰岛素、抗生素及伤口护理) 的同时给与吉粒芬1 5 0 u g ，皮下注射，1 次，日。连用3 天，观察期间的不良反应。对照组同为2 型糖尿病足患者1 2 例。给予常规药物治疗( 胰岛素、抗生素及伤口护理) 。所有入选病例均签署研究知情同意书。3 测量与评估；我们用多普勒超声评估血管状态，肌电图评估神经病变。三数据统计9温州医学院硕士学位论文用S P S S l l 5 软件包进行统计分析。计量资料的主要统计指标均进行正态性检验，正态分布的各指标均已均数标准差表示。计量资料的组间比较采用t 检验，双侧P 0 0 5 ) 。表2 两组糖尿病足患者治疗前s E - s e l e , c t i n 、sI C A M - 1 、外周血白细胞( w B c ) 测定结果塑型里堡! 墼
