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1、流式流式 CBACBA 常见问题常见问题常见问题：Q : 我能不能使用 Coulter XL 去分析我的 CBA 数据？A : 虽然 CBA 试剂盒是为 BD FACScan? 和 FACSCalibur? 流式细胞仪设计的，CBA 试剂盒也可以通过 Coulter XL 细胞仪检测，CBA 版本 1.3 以上的软件具有参数兼容性的特征，可以使用非 BD 公司的仪器分析实验数据，请参阅软件的用户使用指南或者联系技术支持得到进一步的信息。Q : 实验过程中，除了 CBA 的分析试剂盒，我们还需要准备什么？A : 除了试剂盒中所包含的成份外，若要进行 CBA 分析实验，还需要购买 BD 的微量样本
2、多指标流式蛋白定量技术分析软件(cat. no. 0421CD/ 550065)，此软件主要是用于分析您的实验数据。虽然实验数据的分析可以不使用 CBA 的特定软件，但是，由于 CBA 实验中所采集的数据较为繁杂，若不通过专用的 CBA 软件进行分析，则进行数据分析的时间将显着增加。CBA 的专用软件是建立在 Microsoft Excel 的基础上的，用户只需要完全安装 MS Excel 98 或者Version 5.0 即可安装 CBA 的专用软件。此外，用户还需要一个 488纳米激光器及 3 个荧光参数的接收的流式细胞仪(eg: BD FACScan? or BD FACSCalibur
3、 cytometer)。Q : CBA 中使用的微珠是由什么做的？所使用到的微珠的平均半径是多少？A : CBA 中使用的微珠的原料是聚苯乙烯，约为 7.5um。Q : 在 CBA 分析中我应该使用何种型号的试验管？A : 除了 FACSArray 外, 我们建议使用 12x75 mm, 5 ml 的聚苯乙烯管。Q : CBA 分析中在进行标准曲线的配制时，有什么需要特别注意的地方？A : CBA 试剂盒中所提供的标准样品是蛋白冻干粉，由于大部份的标准样品属细胞因子类的敏感型蛋白，在重悬标准样品成溶液或进行标准样品稀释时，不可采用振动混匀及剧烈吹打的方式处理标准样品，在重悬标准样品成溶液时，在
4、加入溶液后，只需放于室温下平衡 15 分钟即可。在进行标准样品的系列稀释时，只需轻轻吹打样品数次即可。否则，由于制成溶液后的标准样品不穏定，经剧烈混匀后易降解失活，影响实验中标准曲线的拟制。Q : 是不是每次实验都要使用一瓶新的标准品？A : 不管是标准品储备液 (x10)或实验中的稀释液中，标准品在配成溶液后不穏定，在配制成储备液 (x10) 的 12 小时后将不能再使用。在每次实验前都要重新配置新的标准品溶液。Q : 为什么振动混合微珠这个实验步骤如此关键？A : 在使用之前，微球必须充分的振动混合，从在微球混合液试管中加入另外一种微球之前，至微珠添加完毕后，直至在送到仪器进行上样检测之前
5、，反应管都必须充分振动混合，这是由于充分的振动能够防止微珠聚集成团。若混合不足会导致在进行样品分析时候出现检测到很少或者没有检测到微珠的情况。因此在使用流式细胞仪分析标准品或者样品之前，必须充分振荡混合微珠。试验管在放置到流式细胞仪上检测前需要振荡混合 3-5 秒钟，这样在 FL3 通道里面能够更好的分辨出带有不同标志的微珠。Q : 操作实验中，哪些步骤需要避光进行？为什么？A : 凡涉及含捕获微球以检测抗体的相关步骤都需避光操作。这是由于 CBA 技术是使用 R-藻红蛋白检测样品的荧光信号。由于使用 R-藻红蛋白报告系统，可使获得 CBA 达到最佳敏感度的分析效果，因此每步添加了检测试剂后都
6、要避光反应。此外，在加入检测试剂时，除了需避光操作外，还需严格遵守试剂盒的要求规范操作（比如：精确的加液） ，因为添加的微珠数量不准确会改变有效捕获面积从而影响检测的敏感性。Q : 我看不到 FL2 荧光信号或者看到的 FL2 荧光信号很弱，怎样解决这个问题？A : 检查样品的稀释度，不要随意的更改要求的孵育时间，在孵育过程中，保护样品试剂管不受到光照。Q : 实验中，在检测的时候我发现微珠聚集在一起，这是什么原因？A : 这可能是因为样品中的细胞因子的浓度太高了。此外，在实验前，请按试剂盒上的操作说明对流式细胞仪上各荧光补偿进行仔细调节，以确保所使用流式细胞仪参数是对应于操作的最优化设定。Q
7、 : 为什么在实验中我的实验结果背景很强/或者全部样品都显示高度的阳性？A : 实验结果背景很强可能是因为样品的浓度太高。请对您的样品,尤其是首次进行检测的体系，进行不同稀释度的检测。如果所有样品都显示阳性或者高于标准品的最高浓度读数，这时候请对您的样品进行进一步的稀释，因为您的样品的浓度已高于本系统的正常检测范围。Q : 为什么在实验中会出现看到微珠碎片和没有看到微珠的情况？A : 如果在样品分析的时候在 FSC/SSC 的检测图中出现碎片，上调SSC 的阈值 C 或者同时上调 FSC 和 SSC 的双阈值。如果在调整 SSC的阈值以后问题依然存在，请重复样品的洗涤步骤或者再次稀释样品。Q:
8、 CBA 的检测结果是否可直接与 ELISA 的分析结果进行对比?A: 不可。因为 CBA 是基于荧光的报告系统实现的，虽然 CBA 系统相对于 ELISA 分析具有良好的优势，能够提供更高的敏感性和更大的浓度检测范围。但是两者得出的实验数据不能够直接比较，需对CBA 的数据通过和已有的 ELISA 数据进行校正，得到两者的相关性结果。Q : 在血清和血浆中，CBA 试剂盒所能够检测到的最低浓度是多少？A : 我们不建议研究者根据标准曲线外推低于标准曲线最低值的实验报告数值。这样的外推操作会增加结果的数学统计学上的变化程度和导致标准差值的增大。最理想的情况是我们做标准曲线的时候增加额外的稀释浓
9、度点（比如 10, 5, 2.5, 1.25 pg/ml） 。当一些蛋白相对于背景(0 pg/ml)没有信号的情况下，我们就可以在最后的样品分析中把这种蛋白排除掉。在常规的免疫分析中，血清和血浆中的一些细胞因子的含量低于检测的最低值以至于不能被检测到。这是因为绝大部分的细胞因子在具有特殊的免疫活性的位点附近起作用，它们的作用效率很高，在许多情况下它们的半衰期很短，而且它们在许多种类型的细胞上都起作用。但是，我们可以推测只有在异常的情况下，它们在系统液体例如血清和血浆中的含量的测定值才会很高。一些作用范围很广的蛋白例如细胞催向因子、激素、生长因子等在血清和血浆中的含量很高，半衰期很长和很容易检测到的情况是不多见的。Q: 小鼠的免疫球蛋白抗体分型 CBA 试剂盒能不能用于定量小鼠的免疫球蛋白总量？A : 这个试剂盒只是针对检测培养悬液中的抗体分型。因为该试剂盒并没有设立一个标准曲线，而血清和血浆中还有大部分的免疫球蛋白的亚型，所以并不建议用于血清和血浆样品中的定量。
