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1、片6 0m i n ；苏木精一伊红染色，光镜下进行组织形态学观察。1 2 3 免疫组织化学观察：将未经苏木精一伊红染色的切片常规二甲苯脱蜡后进行S P 免疫组化染色，在肝组织切片上滴l ：3 0 0 稀释的鼠抗人8 一N O ：一G 单克隆抗体，在4o C 条件下孵育过夜，按照试剂盒的操作步骤进行，D A B 显色，苏木精复染细胞核，自来水冲洗返蓝。常规脱水、透明。中性树胶封固。阅片时，先观察整张切片。再随机选择不同区域的5 个高倍视野，显微镜下拍照并应用图像分析软件对8 一N O r G 表达的吸光度值进行定量分析。1 - 2 4N O 水平检测：用硝酸还原酶( 试剂盒) 法检测肝匀浆中N
2、O 水平。1 3 统计学分析：采用S P s S1 1 0 统计软件进行数据处理，计量资料用面s 表示，用单因素方差分析( A N O V A ) 比较各组间的统计学差异以P 0 0 5 表示差异有统计学意义。 2 结果2 1 小鼠肝组织形态学观察结果：对照组肝细胞核膜完整，核仁清晰。胞浆正常。而染砷组肝脏细胞肿胀，胞浆出现空泡状改变，细胞核固缩、碎裂或溶解，肝组织有明显的病理改变。2 2 肝组织细胞核酸损伤的免疫组织化学观察结果：小鼠肝组织抗8 - N i t r o g u a n i n e 的免疫组化结果显示，染砷组小鼠肝组织细胞中靠近细胞膜的胞浆被染成棕褐色呈现明显的抗8 - N i
3、 t r o g u a n i n e 阳性 反应而对照组小鼠肝组织细胞中几乎无8 一N i t r o g u a n i n e 的表达。各组小鼠肝细胞的抗8 一N i t r o g u a n i n e 免疫染色平均吸光度值明显大于对照组，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) ，并随着砷暴露剂量的增加而呈现明显的剂量一反应关系。 2 3 无机砷对肝匀浆中N O 水平的影响：N O 水平 在中、高剂量组( 1 0 、2 0 斗m o 饥) 明显增高，与对照组比较，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。 3 讨论近年来的研究表明，除了活性氧，活性氮族也可造成核酸损伤。适量的N O
4、 对于维持机体的正常生理功能是必不可少的但过量的活性氮族可能参与了砷的致癌过程。虽然G u r r 等对砷暴露对不同种类细胞的N O 生成情况的影响进行了详尽的综述，P i n e d a 等也发现砷暴露可造成儿童体内N O 生成增多，但是关于砷暴露与活性氮族损伤效应之间的关系报道很少。内源性的活性氮族主要来源于细胞质内一氧化氮合酶介导的L _ 精氨酸代谢途径，包括N O 、N O ：及过氧亚硝基阴离子( O N 0 0 一) 等。活性氧和N O 之间涉及许多信号传导通路。它们之间也存在着协同作用，N O 和O f 可发生快速非酶促化学反应，生成强氧化剂O N 0 0 一，O N O O 一可
5、与鸟嘌呤( G ) 的C 一8 位点迅速反应生成8 - N 0 2 一G ，因为核酸的化学性修饰在D N A 复制过程中可引起突变，因此8 - N O ：一G 被认为是D N A 和R N A 损伤的标志物。有报道8 一N 0 2 _ G 与口腔癌的发生有关，认为8 一N 0 2 _ G 是一种判断是否有癌变倾向的标志物。本实验发现慢性砷暴露小鼠肝脏中8 - N O ：一G的表达增多，同时伴有N O 水平增高，提示砷可能通过活性氮族引起肝组织的核酸损伤，而8 一N O r G 的表达主要集中于细胞浆内，细胞核内染色较少，说明活性氮族对R N A 的损伤比较明显，8 - N O ：一G 的高表达
6、反映了活性氮族诱导的R N A 损伤与砷的肝毒性作用有关。因此，砷可能通过活性氧引起D N A的氧化损伤，而通过活性氮族主要引起R N A 的损伤。本实验应用活性氮族损伤核酸的标志物探讨砷的毒作用机制，为砷的肝毒性机制研究提供了研究前景，同时也提示，8 - N O ：一G 可作为检测砷的肝毒性作用的早期敏感生物标志物。叶酸对砷所致肝细胞毒性和氧化应激状态的影响徐苑苑王惠惠孙贵范( 中国医科大学公共卫生学院劳动卫生学教研室，辽宁沈阳1 1 0 0 0 1 )基金项目：国家自然科学基金重点项目( 3 0 5 3 嘶4 0 ) ；国家科技1材料与方法支撑项目( 2 0 0 6 B J 0 6 8 0
7、 4 )1 1细胞培养与处理：C h a n g 肝细胞株购自中国科 通信作者：孙贵范，g m a f l ：删删L e d u 脚学院细胞库，常规培养于R P M I1 6 4 0 培养液( 含1 0 胎牛血清，1 0 0k U 几青霉素，1 0 0m g L 链霉素) 。细胞生长至8 0 融合后，分别以无叶酸( 0p 。m o l L ) 、正常叶酸( 2 3I z m o l L ) 和高叶酸( 1 0p , m o l L ) R P M I1 6 4 0 培养液预培养lh 而后加入0 或2 0I x m o l L 亚砷酸钠继续培养2 4h 。1 2 细胞活力测定：将C h a n
8、g 肝细胞以1 1 0 8 个L的密度接种于9 6 孔板，待细胞生长至8 0 融合后给予上述各处理，到达培养终点前4h 加入噻唑蓝( M T r ) 工作液继续培养，到达终点后吸弃孔内上清，加入二甲基亚砜( D M S O ) 溶解结晶物。用酶标仪( M u l t i s k a nA s c e n t3 5 4 。芬兰L a b s y s t e m s 公司) 在4 9 0n m 处测定各孔的吸光度( A ) 值。细胞活力( ) =( 实验组A 值对照组A 值) 1 0 0 。1 3 细胞凋亡测定：采用A n n e x i nV 侧双染法检测细胞凋亡状况。收集到达染毒终点的细胞按细
9、胞凋亡检测试剂盒( 南京凯基生物科技发展有限公司) 说明书处理，用流式细胞仪( F A C SC a l i b u r 。美国 B D 公司) 进行检测，激发波长4 8 8n m 。发射波长5 2 5n m ( A n n e x i nVF L I ) 和5 9 5n m ( P lF L 2 ) ，每次计数l 1 0 4 个细胞，用C e l lQ u e s t 软件进行分析。1 4 细胞内活性氧( R O S ) 水平检测：将到达染毒终 点的细胞制备成单细胞悬液加入终浓度为1 0t t m o l L 的D C F H D A 。3 7o C 避光孵育3 0m i n 后收 集细胞，
10、P B S 洗2 次，立即用流式细胞仪( F A C SC a l i b u r ，美国B D 公司) 进行检测，激发波长4 8 8n m ，发射波长5 2 5n m ，每次记数1x1 0 4 个细胞。用C e l lQ u e s t 软件进行分析。1 5 细胞内谷胱甘肽( G S H ) 和丙二醛( M D A ) 水平 测定：分别用G S H 检测试剂盒和M D A 检测试剂盒( 均购自南京凯基生物科技发展有限公司) 对细胞 内G S H 和M D A 水平进行测定用B r a d f o r d 法测定细胞蛋白水平校正细胞内G S H 和M D A 水平。1 6 统计分析：数据用S
11、P S S1 3 0 进行统计分析以x 士s 表示。采用方差分析比较组间差异，进一步两两比较采用L S D 法，所有实验结果均来自3 个以上平行样品或3 次以上重复实验。 2 结果2 1 细胞活力：结果显示，2 0 斗m o l LN a A s O ：染毒2 4h 显著降低C h a n g 肝细胞活力( P 0 0 5 ) ，且砷所致细胞活力的降低在低叶酸条件下进一步加剧( P 0 0 5 ) ，在高叶酸条件下显著减弱( P 0 0 5 ) 。单独给予不同水平叶酸对细胞活力无显著影响。2 2 细胞凋亡：正常叶酸培养条件下，2 0t t m o l LN a A s 0 2 染毒2 4h 使
12、早期和晚期凋亡细胞均显著增多，分别为2 1 7 和1 0 2 ( P 0 0 5 ) 。与正常叶酸条件下的N a A s O ：染毒细胞相比，低叶酸染砷组的早期和晚期细胞凋亡率均显著增高( P 0 0 5 ) 。单独给予不同水平叶酸对细胞凋亡率无显著影响。2 3 细胞氧化应激状态：结果表明。正常叶酸培养条件下，2 0 斗m o L LN a A s 0 2 染毒2 4h ，细胞内R O S 、 G S H 和M D A 水平均显著升高( P 0 0 5 ) 。与正常叶酸条件下的N a A s O ：染毒细胞相比，低叶酸染砷组细胞内R O S 水平显著升高( P 0 0 5 ) ，G S H 水
13、平显著降低( P 0 0 5 ) ；高叶酸染砷组细胞内R O S 和M D A 水平显著下降( P 0 0 5 ) 而G S H 水平显著升高( P 0 0 5 ) 。 3 讨论大量研究显示i A s 的生物甲基化与其毒性发生发展具有重要联系。叶酸是食物中甲基供体的重要来源之一。流行病学调查显示叶酸能够影响砷的甲基化代谢。因此。叶酸很可能对砷毒性具有重要影响，但目前尚缺乏相关报道。此外，营养学调查显示，我国农村，尤其是西北农村人群血清叶酸水平普遍偏低，而这正是我国已发现饮水型高砷暴露最集中的地区。肝脏是砷生物甲基化的主要场所，也是砷中毒的靶器官之一。鉴于此。本研究比较了正常及低、高叶酸条件下砷对人肝细胞系活力、凋亡和氧化应激状态的影响为进一步研究高砷暴露区人群健康状况与叶酸摄入的关系提供参考依据。本研究结果显示：砷致细胞活力降低、凋亡和氧化应激作用在低叶酸条件下增强，高叶酸条件下减弱。氧化应激是砷中毒的重要机制之一，本研究组以往研究发现砷致细胞凋亡与细胞内R O S 的水平密切相关。叶酸除影响砷代谢外也是一种抗氧化剂，在生理p H 条件下，它不但能够清除某些自由基，还具有巯基修复作用，这与本研究的结果具有一致性。因此，叶酸可能是通过影响砷代谢和氧化应激的双重机制对砷致细胞毒性产生影响。
