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1、广州医学院硕士学位论文广东家庭聚集性登革3型病例特征及其病毒株全基因组序列分析姓名：周伟泽申请学位级别：硕士专业：内科学 传染病指导教师：张复春20100501广州医学院硕士学位论文 广东家庭聚集性登革 3 型病例特征及其病毒株全基因组序列分析 1广东家庭聚集性登革3型病例特征及其 病毒株全基因组序列分析 广东家庭聚集性登革3型病例特征及其 病毒株全基因组序列分析 专 业：内科学 传染病专业 学位申请人：周伟泽 导 师：张复春 教授 摘摘 要要 登革热是由登革病毒通过蚊虫叮咬传播引起的急性传染性疾病。其病毒可分为四个血清型（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）。目前登革热已
2、在热带及亚热带地区超过 100 多个国家流行，威胁到全球超过 40%人口的健康。据 WHO 估计，目前全球每年有约1亿登革热患者， 其中有登革出血热及登革休克综合症(DHF/DSS)患者约 50 万，死亡人数 25000 人。在我国，登革热主要在沿海地区流行，其中以广东省最为严重。自 1978 年以来，广东几乎每年都有登革热的流行，且四型登革病毒都有过流行，但广东登革热的研究目前主要集中在 DENV-1 和 DENV-2，而对DENV-3 及 DENV-4,目前的研究资料都很少。而近十年来，广东主要还是以登革 1型病毒流行为主，未有其它型 DENV 感染病例的报道。因此，密切关注临床登革热病例
3、、及时获取早期样本、分离野生型登革毒株、研究分析其临床和病原学特征，对于全面了解广东登革热的流行形势及特点、病原体的来源及防治等均具有重要意义。 研究目的：研究目的：分析 2009 年 8 月发生于广东省广州市的一起家庭聚集性的 3 例登革热病例的临床和实验室检查特征，从患者血清中分离病毒株并进行全基因组序列测定及分析，了解 2009 广东登革病毒流行特点及病原体基因组特征，以明确广东登革热的分子流行病学趋势和特点。 广州医学院硕士学位论文 广东家庭聚集性登革 3 型病例特征及其病毒株全基因组序列分析 2研究方法： 1.研究方法： 1.收集三例登革热患者的临床及实验室资料,并用 Excell
4、表进行统计分析；采用胶体金法检测三名临床登革热病例发病期和恢复期血清登革 IgM、IgG 抗体，并用ELISA 细胞因子检测试剂盒检测三名登革患者发病期及恢复期血清 IL-6、IL-10、IFN-、sTNFR1(可溶性肿瘤坏死因子受体-1)、TNF细胞因子的水平； 22采用 RT-PCR 法扩增血清登革病毒 C-PrM 基因区序列，并对 PCR 产物进行电泳及测序分析； 33用 C6/36 细胞接种感染者血清，以分离登革病毒株； 44用 PCR DESIGN 和 DNAclub 软件设计扩增登革病毒全基因组序列的 11 对 PCR 引物， 经 RT-PCR 扩增和 T 载体克隆后进行测序， 并
5、对测序结果进行生物信息学分析。 研究结果： 1研究结果： 1三名患者发病前均有蚊虫叮咬史，2 周内没有外出史，临床特征有发热头痛，颜面潮红，疲乏，关节肌肉痛，皮疹，束臂实验阳性，白细胞减少；3 名患者急性期血清登革 IgM 抗体均为阳性，恢复期血清登革 IgG 抗体均为阳性；符合登革热的临床诊断；血清 5 种细胞因子发现，三名患者急性期血清 IL-10、sTNFR1、IFN-细胞因子水平高于健康对照组和恢复期； 22三名患者血清 RT-PCR 产物经电泳分析后均出现大小为 290bp 左右的特异性片段，PCR 产物经测序鉴定，证实均为登革 3 型病毒感染，且三例患者血清病毒序列完全一致； 33
6、用 C6/36 细胞成功从其中 1 名患者急性期血清中分离出登革病毒株；经全基因组序列测定，广东登革 3 型病毒株全长 10707bp,进化树显示该病毒株为登革 3 型病毒亚型毒株； 4.与目前测定的最古老的登革 3 型病毒亚型毒株相比，广东 2009 年登革 3 型病毒株发生了碱基变异 377 个，氨基酸变异 39 个。 结论： 结论： 12009 年广东一起家庭聚集性的 3 例登革热病例均为登革 3 型病毒首次感染，这是近十几年来广东首次发生本地家庭集聚性登革 3 型病例。 广州医学院硕士学位论文 广东家庭聚集性登革 3 型病例特征及其病毒株全基因组序列分析 32 这是广东省首次成功培养分
7、离出登革3型病毒株并完成了全基因组序列的测定，进化树分析确定本次流行株为登革 3 型病毒亚型毒株。该病毒株共发生碱基变异 377 个，氨基酸变异 39 个。 关键词：登革热；登革关键词：登革热；登革 3 型病毒；临床特征；细胞因子；全基因组序型病毒；临床特征；细胞因子；全基因组序 广州医学院硕士学位论文 广东家庭聚集性登革 3 型病例特征及其病毒株全基因组序列分析 4The characteristics of family-clustered dengue fever cases and analysis of full genomic sequence of the dengue viru
8、s type-3 strain in Guangdong Major: Infectious Disease Master Candidate: Weize Zhou Supervisor: Professor Fuchun Zhang Abstract Dengue fever （DF）is an acute infectious disease caused by dengue virus(DENV) infection, which is transmitted through the bite of infected mosquito .There are four serotypes
9、 of dengue virus（DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4）.DF is now endemic in more than 100 countries in tropical and subtropical areas, and threatens the health of approximately 40% of the worlds population. The World Health Organization estimates that there may be around 100 million cases of dengue virus inf
10、ection worldwide every year, resulting in approximately 500,000 cases of DHF/DSS and 25,000 deaths each year . Dengue mainly prevalent along the coast areas in China, while Guangdong province is the most affected area.Since 1978, there are dengue cases reported almost every year,all four serotypes o
11、f dengue virus have epidemics in Guangdong .But the 广州医学院硕士学位论文 广东家庭聚集性登革 3 型病例特征及其病毒株全基因组序列分析 5research of DF in Guangdong was major in DENV-1 and DENV-2, however, little is known about DENV-3 and DENV-4. In the last ten years , the dengue endemic in Guangdong was mostly caused by DENV-1 ,no other
12、serotype of DENV infected case was found . So we must pay close attention to clinical DF case, get the early specimen on time and isolate the wild strain of dengue virus, research and analyze the character of its clinic and pathology. All these are significant to understand the epidemic situation an
13、d its character, source of pathogen and control and prevention of DF in Guangdong Aim of this research: Analyze the clinical and laboratory characteristics of 3 cases of a family-clustered dengue fever in city of Guangzhou in Guangdong province August 2009 . Isolate dengue virus strain in serum from
14、 the patients, then sequence and analyze the whole genome of the virus, to find out the characters of dengue virus epidemic and the genome of the pathogen in Guangdong in 2009, so as to confirm the characteristics of molecular epidemiology of dengue fever in Guangdong . Research Methods: 1. Collect
15、clinical and laboratory data of the 3 dengue fever patients, statistical analyze the data by excel; dengue virus specific IgM and IgG antibody were detected by Collidal gold method in patients serum 广州医学院硕士学位论文 广东家庭聚集性登革 3 型病例特征及其病毒株全基因组序列分析 6collected in acute phase and convalescence phase; cytokin
16、e levels of IL-6、IL-10、IFN-、sTNFRI、TNF were detected by ELISA in patients serum collected in acute phase and convalescence phase. 2. Amplify the C-PrM gene in dengue virus by RT-PCR, electrophoresis and sequence analyze the PCR product. 3. Inoculate cell C6/36 with serum from patients to isolate the strain of dengue virus. 4. Through software of DNA DESIGN and DNAclub, design 11 pairs of primer which could amplify t
