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1、海峡两岸中医药发展大会C r o s s S t r a i tC o n f e r e n c eo nt h eD e v e l o p m e n to fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e从代谢组学角度探讨白附片对正常和肾阳虚证大鼠毒性反应差异谭勇1吕诚1吕永恒2 李小冰1 许国旺3吕爱平1 1 中国中医科学院中医临床基础医学研究所北京1 0 0 7 0 02 天津市南开区理疗医院3 中国科学院化学物理研究所辨证论治是中医药学理论的特色与精华，是中医临床、科研必须遵循的基本准则。“证”是疾病在发展过程中某一阶段病理变化
2、的全面概括。根据黄帝内经“有故无殒”的中药毒性理论，用药只要对证，药物毒性自然减低。这反映了中医强调药物毒性具有相对性和必须结合证候来评价中药毒性的理念。因此，以中医药学独特的思维模式与辨证理论为指导，选用恰当的中医病证动物模型评价中药的毒性，才能得到能够真正准确反映中药毒性的结果，才能为确保临床安全、有效、合理用药提供科学依据。本研究结合代谢组学方法探讨白附片对正常和对证模型大鼠毒性反应的差异，为基于中医证候理论评价中药毒性提供客观依据，为深入分析证候与中药毒性关系提供方法学探索。1 材料1 1 动物S P F 级雄性S D 大鼠8 0 只，体重( 2 0 0 2 0 ) g ，由军事医学科
3、学院提供【合格证号：S C X K - ( 军)2 0 0 7 - 0 0 4 。饲养在中国中医科学院中医基础理论研究所实验动物室( 许可证号：S K Y I I 0 0 - 0 0 3 9 ) ，室温( 2 3 2 )，食用全价营养颗粒饲料，饮用纯净水。1 2 药物和试剂注射用氢化可的松琥珀酸钠粉针剂( 天津生物化学制药有限公司，生产批号2 0 0 8 0 6 0 4 ) ，用生理盐水配成浓度为7 1 4 3 m g m L - 1 的溶液。白附片( 北京燕京饮片厂，批号0 8 1 1 1 7 ，产地：四i I ) ，甩乙醇提取制成2 9 m L - 1 的溶液( 由中国中医科学院中医基础理
4、论研究所方证研究中心提取) 。提取工艺；白附片加入8 倍量的6 0 乙醇中浸泡4 0 m i n ，回流2 h ，滤过：再加入6 倍量的6 0 乙醇，回流l h ，滤过：合并滤液，制成浓度为2 9 m L - 1 的药液。血清促肾上腺皮质激素( A C T H ) 、皮质醇( C O R ) 、环磷酸腺苷( c A M P ) 和环磷酸鸟苷( c G M P ) 放射性免疫试剂盒由北京普尔伟业生物科技有限公司提供。代谢组检测用试剂由中国科学院化学物理研究所色谱研究分析中心提供。1 3 主要仪器S n 6 9 5 1 3 型免疫计数器，液相色谱系统采用A C Q U I T Y - U l t
5、r aP e r f o r m a n c eL i q u i dC h r o m a t o g r a p h ys y s t e m ( W a t e r sC O R P ，M i l f o r d ，U S A ) ，质谱系统采用M i c r o m a s s Q - T O F ( W a t e r sM ST e c h n o l o g i e s ，M a n c h e s t e r ，U K ) 。2 方法2 1 模型的建立大鼠臀部i I I l 氢化可的松琥珀酸钠溶液，剂量为3 5 7 1 5 m g K g 1 d - 1 ，连续9 d 。2 2
6、 实验分组8 0 只大鼠适应性喂养7 d 后随机分为正常组和模型组，造模结束再把两组大鼠分别随机分为低剂量、小剂量、中剂量和大剂量4 个给药组和空白对照组，每组8 只。2 3 给药方法分组当天对给药组和空白对照组大鼠分别灌胃给予白附片溶液和生理盐水。给药浓度从低到高依次为：0 3 2g ，O “g ，1 2 8g 和2 5 6g K g 1 d l 。连续1 4 d 。2 4 血清和血浆的制备i p3 戊巴比妥钠1 5 m L K g - l 麻醉大鼠，暴露股动脉，快速剪断血管，用吸管吸取血样，制备血清和血浆。2 6 观察指标按试剂盒说明书，放射性免疫法检测血清A C T H ，C O R ，
7、c A M P 和c G M P 。采用高效液相色谱质谱联用的代谢组学技术检测内源性代谢物。2 7 统计方法采用广义线性模型两因素方差分析，显著性水平取P 3 ) 进行结构鉴定，见表2 ；C 瞄s - S 嘧i c C 缸螂o t h e D “e 1 t o f T t a d , f i c “t l a l i n c M c d i c i 耻海蚨两岸中医药技展大台表2 两空自组分类贡献最 的代谢物结构鉴定注：眦指溶血礴脂酰L 醇胺，眦指溶血碡脂醐a 碱。下同表2 显示：1 8 ：0 L P E 2 0 ：3 L P c 2 0 | _ S L F C 和1 8 ：3 L P C 是使
8、常大鼠和肾阳虚模型大鼠分开的t 要血浆标志物33 常培药组与模型蛤药组大鼠代谢谱型的差异33l 构建0 P 玷真妾配强 ：*H jm “图3 正常和模型给药纽O 。L S 得丹圉圈4 正常和模型给药组o P 蝤分析戴荷图围3 显示：常蛤药组与模型培药组可咀根好地醢分开说明模型与常太鼠对于相同药铷代谢哺应存在着差异。332m 常碧药组与模型给药组分类贡献最大的代谢物对圈4 中分类贡献最 的代谢钫( 标志物V I P 3 ) 进行结构鉴定，见表3 。表3 正常培药组与模型给药蛆分类贡献最大的代谢物结构鉴定表3 显示I $ ：0 L P E 和2 0 5 L F C 足正常和楼型大鼠绪予向附片后两者
9、血装代谢不同变化的主要标志物34 各标志物在E 常组与模型组中平均响应随蛤药剂量的变化情况注：正常和摸型组自各蛤药组与其空自对月维比段，* p 0 0 5 ，+ 口 0 0 1 “p O o o l 。海峡两岸中医药发展大会C r o s s S t r a i tC o n f e r e n c eo nt h eD e v e l o p m e n to fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e2 5 0 0 02 0 0 0 01 5 0 0 0l 0 0 0 05 0 0 0n 空白对照低剂量小剂量中十正常组+ 模型组图5
10、 正常和模型大鼠血浆中1 8 ：0 L P E 随剂量变化情况图5 显示：空白剂量时，模型组1 8 ：0 L P E 低于正常组：正常组1 8 ：0 L P E 随剂量的增加有下降的趋势，而模型组变化不明显。1 8 0 0 01 6 0 0 01 4 0 0 01 2 0 0 01 0 0 0 08 0 0 06 0 0 04 0 0 02 0 0 0，、 空白对照低剂量小剂量中十正常组 十模型组图6 正常和模型大鼠血浆中2 0 ：5 L P C 随剂量变化情况图6 显示：空白剂量时，模型组2 0 ：5 L P C 低于正常组；正常组和模型组2 0 ：5 L P C 均随剂量的增加有下降的趋势
11、，模型组下降的较缓慢。7 0 0 06 0 0 05 0 0 04 0 0 03 0 0 02 0 0 01 0 0 0O 空白对照低剂量小剂量中+ 正常组 + 模型组图7 正常和模型大鼠血浆中m z 3 0 2 6 随剂量变化情况图7 显示：正常组和模型组未知代谢物m z 3 0 2 6 均随剂量的增加有升高的趋势，模型组升高的较缓慢。4 4 2海峡两岸中医药发展大会 曼婴! ! ：! 鲤! 竺2 翌塑竺竺2 里塑! 望! ! ! 塑婴12 1 里堂旦型坠呈! 兰丝堂堂1 2 0 0 01 0 0 0 08 0 0 06 0 0 04 0 0 02 0 0 00 空白对照低剂量小剂量中+ 正
12、常组 + 模型组图8 正常和模型大鼠血浆中m z 4 6 8 4 随剂量变化情况图8 显示：正常组和模型组未知代谢物m z 4 6 8 4 均随剂量的增加有下降的趋势，模型组下降的较缓慢。4 5 0 04 0 0 03 5 0 03 0 0 02 5 0 02 0 0 01 5 0 01 0 0 05 0 0空白对照低剂量小剂量中+ 正常组 + 模型组图9 正常和模型大鼠血浆中m z 3 1 8 6 随剂量变化情况图9 显示：正常组和模型组未知代谢物m z 3 1 8 6 均随剂量的增加有升高的趋势，模型组升高的较缓慢。4 讨论现代毒理学研究表明机体功能状态与药物毒性反应密切相关【1 l 。中
13、药临床应用特别强调药证对应韵重要性，认为只要对证，就能最大程度避免药物毒性反应的发生。目前多采用正常动物评价中药的毒性，这与中医辨证论治的临床实践不相符。因此，在“对证”的条件下研究中药的毒性更有必要性 2 1 。白附片是中药毒性和药效研究的代表药物，肾阳虚是其治疗适应证候，本研究通过建立肾阳虚大鼠模型评价其毒性。现代研究证实：“下丘脑垂体靶腺”轴不同环节、不同程度的功能紊乱导致的肾上腺皮质功能减退是肾阳虚证的主要病理基础，主要表现在血液中A C T H 、C O R 、c A M P 水平降低而c G M P 升剐3 _ 】。通过肌注糖皮质激素建立的肾阳虚大鼠模型，是比较公认的肾阳虚证中医动
14、物模型，其血生化表现符合上述变化【5 1 。本研究发现，氢化可的松造模可引起血浆代谢物L P E 和L P C 的下调。L P E 和L P C 是机体的溶血性甘油磷脂，它们的活性升高具有重要的意义，主要表现为：能够正向调节基质金属蛋白酶的产生，促进细胞外基质及基底膜的降解；有助于激活蛋白激酶C ，蛋白激酶C 激活为血小板激活的标志，在血小板聚集中起着重要的调节作用：可抑制淋巴细胞的凋亡，有助于淋巴细胞的活化1 6 - 9 1 。L P E 和L P C 是在磷酯酶的作用下由P E 和P C 生成的，机体内P E 和P C 的含量决定了L P E 和L P C 的水平 2 7 1 。P E 和
15、P C 具有抗氧化和降血脂的功用，它们主要在机体各组织细胞内质网中合成，其中以肝组织最活跃【1 0 1 n 。氢化可的松造模可引起肝细胞R N A 含量下降、各种酶的活性下降和肝糖元减少等肝损害【1 2 】，从而导致P E 和P C 下降。因此，造模引起的肝损害可能是肾阳虚模型大鼠L P E 和U ，c 下降的原因。随着白附片剂量的增加，正常大鼠L P C 和L P E 有明显下降的趋势，而模型大鼠L P C 和L P E 水平基本保持在稳定状态。白附片的主要毒性成分是乌头碱。乌头碱可引起心肌细胞缺氧，导致心肌A T P 大量耗竭【1 3 1 。而A T P4 4 3海峡两岸中医药发展大会C
16、r o s s S t r a i tC o n f e r e n c eo nt h eD e v e l o p m e n to fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e释放能量是P E 和P C 合成过程中的必要环节【l o l 。乌头碱对正常大鼠的毒性作用明显，而对肾阳虚模型大鼠不产生明显的毒性作用，这可能是正常大鼠血浆L P C 和L P E 下降而肾阳虚模型大鼠保持稳定的原因。本研究发现一些未知血浆代谢物，随着白附片剂量的增加，两种大鼠有不同的变化趋势，进一步说明了白附片对正常大鼠和肾阳虚模型大鼠的影响不同。代谢组学研究所发现的白附片对不同状态大鼠的血浆代谢物影响差异，其具体详尽机理还有待进一步研究。总之，本研究发现L P C 和L P E 是白附片引起正常和肾阳虚模型大鼠血浆代谢物变化的主要标志物，两者随白
