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1、感受态细胞制备一、 实验目的1、掌握氯化钙法制备感受态细胞的原理、方法和技术； 2、掌握电转化感受态细胞的制备原理及方法； 3、学习并掌握感受态细胞效价的检测方法。二、 实验原理在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应 的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。 质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基 因。细菌吸收外源 DNA 的能力最高时的状态被称为感受态细胞。有些种类的细菌 在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时，才会 处于感受态,如大肠杆菌。大肠杆菌的感受态细胞制备原理
2、是取对数生长期的细菌 处于 0，CaCl2 的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42短时间热冲击处理，促使细 胞吸收 DNA 复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值， 被转化的细菌中，重组子中基因得到表达。对这种现象的一种解释是 CaCl2 能使细 菌细胞壁的通透性增强，目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细 胞上形成孔洞，使外源 DNA 进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往 往比化学法高出 1 到 2 个数量级，达到 1 x 108转化子每 1g DNA，甚至 1 x 1
3、09 转 化子每 1g DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选 化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70保存，因此被广泛用于外源基因的转化。 物理制备法： 电转法，除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌 的感受态，依靠短暂的电击，促使 DNA 进入细菌，转化率最高能达到 109 1010 转化子/g 闭环 DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计 算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化率（转化子数每 g 质粒
4、 DNA）转化子总数质粒 DNA 加入量(g) 理论上转化率最高为每微克地标准质粒转化的菌落数为 1*1010 三、实验材料 实验仪器：恒温振荡仪、恒温培养箱、低温常速离心机、移液枪、锥形瓶、离心管、 LB 液体培养基、 实验试剂：0.1M CaCl2溶液、含 10%甘油的 0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘 油的水溶液、DH5、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。 三、实验步骤 （一）化学感受态细胞的制备 （1）菌种的活化：取-70的冰箱中感受态细胞 DH5、Top10、DE3、BL21 在 LB 的平板上进行划线分离。 （2）菌种的前培养：从 LB 平板上挑取相应的单
5、菌落,接种于 10ml LB 液体培养基中，37振荡培养过夜至对数生长中后期。 （3）菌种的准备：将该四种菌悬液以 1:100 的比例分别接种于四个不含有抗生 100mlLB 液体培养基锥形瓶中,37振荡培养大约 2.5 小时至 OD=0.40.5。 （4）感受态细胞的制备： 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把 100 mL 培养液均匀分成两份到 50 mL 离心管中，在 4、3000 转每分钟，离心 10min。 弃去上清液，加入 30 mL 0.1M 的 CaCl2溶液，轻轻混匀，在冰水中静置 30min。 弃去上清液，加入 30 mL 0.1M 的 CaCl2溶液，用巴氏管轻轻吹吸让
6、沉淀充分混匀， 在冰水中静置 30min。 从冰水中取出 4、3000 转每分钟，离心 10min，弃去上清液并用移液枪轻轻地 把多余的液体吸干净，加入 0.5 mL 含 10%甘油的 0.1M CaCl2溶液。用巴氏管轻轻吸 起液体打到壁上使沉淀混匀并放置在冰上。 把液氮倒到小的塑料盒子里，在离心管架子上摆放好 0.5ml 离心管，用剪过的移 液枪头进行分装，每个离心管中分装 40L 悬浮液。 迅速盖好盖子放入到液氮中，使之迅速冷冻，然后放到标有感受态细胞种类、制 作者和时间的袋中，-70保存。 （二）电转化的感受态细胞的制备 第 1、2、3 步同化学转化的感受态细胞的制备过程的 1、2、3
7、 三步相同。 （4）制备感受态细： 把上述的锥形瓶放到冰水快速使其冷却。把 100 mL 培养液均匀分成两份到 50 mL 离心管中，在 4、3000 转每分钟，离心 10min。 弃去上清液，加入 30 mL 三蒸水，用巴氏管吸起液体打到离心管壁上使沉 淀充分混匀，在 4、3000 转每分钟下离心 10min，倒去上清。重复两次； 再加入 30 mL 含 10%甘油水溶液，在 4、3000 转每分钟下离心 10min，重 复一次。 弃去上清液，加入 0.5 mL GYT medium(含有 10%Glysiron、0.125%Yeast Extraction、0.25% Trypton)，放
8、置在冰上。 （5）准备好成有液氮的塑料盒子和把 0.5 mL 离心管若干放到离心管架子上，将悬 浮的感受态细胞分装在离心管中，每管 40l，迅速盖好盖子放入到液氮中，使之 迅速冷冻，然后放在标有感受态细胞种类、制作者和时间的袋中， -70保存。 （三）效价检测 1、化学转化： （1）取化学转化感受态细胞于冰上解冻，同时把标准质粒 PUC19 稀释十倍置 于冰上。 （2）在含有 40l 感受态细胞的 0.5ml 离心管中加入 1L 稀释后的标准质粒充 分混匀。冰上静置 30min。 （3）将离心管置于 42干式恒温器上 90s，然后迅速放回冰上，使细胞冷却 23min。 （4）向离心管中加入已预
9、热的无菌 LB 培养液 400L，再转移到 10ml 离心管 中，37恒温振荡培养 4560min。 （5）将离心管内容物混匀，分别吸取 4.4L 和 110L 菌液于含有 AMP 的 LB 固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开，将平板置于室温下直到 液体被吸收，倒置平板，在 37过夜培养，然后通过菌落数计算效价。 2、电转化:（1）取电转化感受态细胞于冰上解冻，,标准质粒也置于冰上，同时准备干净 的电击杯于冰上预冷。 （2）在含有 40l 感受态细胞的 0.5ml 离心管中加入 1L 稀释十倍的标准质粒， 充分混匀。然后转移到电击杯中，把电击杯放在电击仪上进行电击（2500V，
10、5ms） 。（3）在电击杯中加入 160L 无菌 LB 培养液（无抗生素） ，然后充分混匀，吸 取于 10ml 离心管中，置于 37恒温振荡器中培养 4560min. （4）分别取 2L 和 50L 涂板，涂板操作同化学转化。 （5）平板放到 37的恒温培养箱过夜培养。第二天早上读取两个平板的菌落 数。 四、实验结果 1、电转化感受态细胞的效价：涂 2L 菌液的平板上菌落数为 88 个，通过计算 知道，电转化感受态细胞的效价为 8.8108。 2、化学转化感受态细胞的效价：无菌落生成，同组的也没有出来结果。 五、讨论 1、感受态细胞制备及转化中的影响因素 细胞生长状态和密度: 不要用经过多次转
11、接或储于的培养菌，最好从70或-20甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。细胞生长密度以刚进入对数 生长期时为好，可通过监测培养液的 OD600 来控制。密度过高或不足均会影响转化效率。 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒 DNA 应主要是超螺旋态 DNA。转化效率与外源 DNA 的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源 DNA 的量过多或体积过大时,转化效率就 会降低。1ng 的标准质粒即可使 50l 的感受态细胞达到饱和。一般情况下,DNA 溶液的体 积不应超过感受态细胞体积的 5。 试剂的质量: 所用的试剂,如 CaCl2 等均需是最高纯度的，并用超纯水配制，最好分 装保存于
12、干燥的冷暗处。 防止杂菌和杂 DNA 的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿, 如离 心管,枪头等最好是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、 DNA 酶或杂 DNA 所污染, 否则均会影响转化效率或杂 DNA 的转入, 为以后的筛选、鉴定带 来不必要的麻烦。 整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低。 2、效价检测结果分析： 化学转化感受态细胞效价检测结果没有转化成功，而且所有人的结果都没有转化结果， 所以造成该结果的可能原因是制备感受态细胞所使用的试剂配制有误。 电化学转化的结果有菌长出，在涂 2l 的菌液的平板上有 80 个菌落。标准质粒的浓度 为 0.1ng/l。使用时稀释十倍。所以 2l 的菌液中有 0.1pg 的标准质粒。那么转化率 =80/0.1*10-6=8*108
