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1、碘化丙啶（propidium iodide, PI）检测凋亡细胞早期死亡细胞膜通透性状态的不同是区分细胞凋亡和坏死的一个重要指标，凋亡细胞在进 入最终溶解阶段前，胞膜通透性无明显改变，相对分子质量大的与 DNA 结合的荧光染料 （如 PI）不能时入凋亡细胞内，而相对分子质量小的荧光染料（如 Hoechest 3342 或 33258 等）仍能被细胞摄取。应用流式细胞仪或荧光显微镜可区分和坏死细胞，细胞内 DNA 出现 Hoechest 3342 标记而不出现 PI 标记的为凋亡细胞。 主要操作步骤如下：组织块用 0.25%胰酶消化 30min1h。200400 目筛网过滤细胞， 获得单细胞悬液
2、。75乙醇（-20预冷）固定细胞 1h。加入 PI（终浓度 50gmL） 和无 DNA 酶污染的 RNA 酶（终浓度 50gmL）1mL 染色 30min1h。流式细胞仪检测 细胞周期和凋亡细胞凋亡情况观察及凋亡率检测 培养 48h 后细胞分为两部分，一部分行碘化丙啶( pI )染色，倒置相差显微镜下观察细胞核 形态变化。另一部分以胰酶消化后收集， 以 1800rmin 离心 5min，弃培养基，用 4预 冷的 PBS 洗细胞 2 次，离心去 PBS，加入 4预冷的 70的乙醇 4固定 1h，离心弃去 固定液， 用 4预冷 PBS 3ml 洗细胞 2 次，加人 1ml PI，4避光 30mi
3、n 。采用流式细 胞仪检测凋亡率。http:/ 流式检测细胞周期 要点： 最关键的就是减少细胞碎片和单细胞悬液的制备！ 1、细胞消化要理想，资料显示最好消化时加 EDTA，可使流式做的很漂亮； 2、细胞消化后不可吹打过度，减少细胞破碎；以后的吹打也要注意，尤其是固定后的细胞 容易破碎； 3、 细胞用 PBS 洗涤离心，转速不超过 1000r/min，有文献用 800r/min；可考虑在此过程 中用 300 目的尼龙网过滤一遍细胞（有人主张用钢网，以 减少细胞与尼龙网粘连的损失， 本人认为钢网易损伤细胞，DNA 外溢也会造成细胞粘连，所以在细胞数足够的情况下，首 选尼龙网） ； 4、离心后的固定
4、，标准做法是将细胞悬液加入预冷 70酒精，而不是向细胞中加酒精， 这样是为了减少细胞聚集，这一点很重要，很多人都忽视了！ 5、一般选择 4固定过夜； 6、加染液前的洗涤仍要注意离心转速的问题； 7、 关于 PI 染液的组成及配方，应主要以文献为主，PI（作用为 DNA 染色剂）的浓度从 0.5g/ml,20g/ml，到 50g/ml 都见报道，响应的 求助显示都可出良好结果，RNAs 酶（由 于 PI 也可染 RNA，故要去除 RNA）一般浓度为 50g/ml，配方中的 Triton-X-100（曲拉通） 主 要是通透细胞膜使 PI 能进入细胞核。 8、检测时细胞要达到 12106 个细胞（实
5、际检测是 1 万到 2 万个细胞） ，为了既保持初 始条件相同，又可搜 集到足够的细胞，应选用多孔培养板，在搜集细胞时，浓度大、抑制 强的组可多搜集些孔，以保证检测的细胞数量。如果细胞数量太低，技师为了减少对流式 细胞仪 的损伤，就会选择高速流（一般的检测用低速流，误差小） ，检测的质量就会大大 下降，数据的说服力就下降了！画两个点图：FSC/SSC、FL2-W/FL2-A，画两个直方图：FL2-H、FL2-A。 将 FL2 的阈值设在 20。 选择 FL2 做为 DDM 参数（区分细胞粘连的参数） 。 将 FL2 设为 LIN 模式。线性模式有利于区分 G0/1 和 G2/M 期细胞。 将
6、FL2、FL2-A、FL2-W 的倍增（Amp）设置为 1.00。 样本上机，以低速（LOW）获取细胞，低速可保证细胞之间的差异尽可能的小，保证更高 的精确度。 调整 FSC、SSC、FL2 的电压，使 FL2-A 直方图上 G0/1 峰值在 200，使 FL2-W 直方图上 的细胞群大部分位于 200 至 600 之间。流式步骤： 取对数生长期细胞，常规消化制成单细胞悬液，以 1.25 105/ml 密度接种于 T-25 培养瓶中， 24h 后加入各浓度消癌平注射液(10, 20, 40mg/ml)培养 24h，收集所有细胞，将约 1106个 细胞移入离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，弃去上清后，用 PBS 溶液清洗一次，在离心管 中留约 0.5mlPBS，加入 70冰乙醇 5ml 混匀固定，4放置 48h 以上。检测时，离心离去 乙醇，PBS 清洗一次，在离心管中留 1mlPBS，打散细胞团，加入 Rnase5ul(10mg/ml)，37放置 1h，加入 PI（100ug/ml）染液，室温避光染色 30 分钟，计数 10000 个细胞，流 式细胞仪检测细胞周期时相和凋亡情况，进行细胞凋亡的分析，亚 Go/G,峰为凋亡细胞峰。
