《H2O2对纤维环细胞凋亡的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《H2O2对纤维环细胞凋亡的影响（4页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中华中医药学会骨伤分会第四届第二次学术大会论文汇编H 2 0 ：对纤维环细胞凋亡的影响上海中医药大学脊柱病研究所，上海中医药大学附属龙华医院周泉，李晨光，张珉，卢盛，周重建，施杞，王拥军椎间盘退变主要表现为椎间盘细胞的凋亡和细胞外基质合成和分泌的减少，本次研究采用H z 0 2 诱导纤维环细胞凋亡，探讨凋亡机理，建立一个用于机理研究的椎间盘纤维环细胞凋亡模型。材料与方法1 主要试剂和仪器：流式细胞仪( B D 公司，美国，F A C S C a l i b u r 中国科学院上海生科院生化细胞所) ，B i o f u g e2 2 R 低温高速离心机( H e r a e u s 公司，德国
2、) ，G E N M E D 细胞T U N E L 测定试剂盒( G S M l 0 0 2 2 1 ) 。2 细胞凋亡的诱导2 1 分组：正常对照组细胞第1 I I 代椎间盘纤维环细胞，使用2 0 小牛血清培养液常规培养传代。H ：0 。诱导凋亡组，使用I I I 代椎间盘纤维环细胞，根据H 2 0 。浓度分成3 组，浓度分别为2 0 ，1 0 0 ，5 0 0 u M的H ：0 2 。总共4 组。2 2 诱导方法将I I 代细胞以2 X 1 0 4 m l 密度接种于内置玻片的六孔培养板和培养瓶内，培养第7 天时，去上清液后随机分成3 个组，依次分别加入含l O d x 牛血清D M E
3、 M 配制的H z O z ，浓度分别为2 0 ，1 0 0 ，5 0 0 u M的H ：0 2 ，继续培养2 4 h 后，收获细胞用于实验。3T U N E L 法检测凋亡3 1 原理：细胞凋亡时D N A 会产生断裂或缺口，可以在末端转移酶的作用下将荧光素标记的d U T P掺入D N A 缺口或接在断裂的D N A 一端，然后接上辣根过氧化酶标记的抗荧光素抗体P O D ，最后通过底物D A B 显色。T U N E L 法可以显示单个细胞的凋亡状况和组织定位。3 2 操作步骤：取培养椎间盘纤维环细胞玻片。阳性对照用D N a s eI ( 1 m g m 1 ) 消化1 0 分钟后加入
4、T U N E L 反应混合液；阴性对照在T U N E L 反应混合液中只加入标记液。操作步骤如下：玻片固定，P B S 洗2 次后；2 0 u g m l 蛋白酶K ，3 7 0 C 消化3 0 分钟：P B S 洗2 次后，在冰上加O 1 的T r i t o n 一1 0 0 柠檬酸钠2 分钟。0 3 H 2 0 z 甲醇室温3 0 分钟：P B S 洗2 次，同时配制T U N E L 酶5u l ( 0 5u lT d T ，2 u lC o C l ，l u l5 反应缓冲液，1 5 u l 双蒸水) 。将5 ulT U N E L 酶与4 5 u lT U N E LL a b
5、 e l 混合成反应混合液，加在切片组织上，湿盒内3 7 0 C3 0 分钟。为使酶作用均匀，在组织上覆盖P a r a f i l m 膜。P B S 洗3次后加5 0 u l T U N E LP O D ，覆盖P a r a f i l m 膜，湿盒内放置3 0 分钟。P B S 洗3 次后加P O D 底物D A B 。D A B先稀释并加入3 H ：0 ：至终浓度为0 0 3 ，加入切片显色1 5 “ - - 3 0 分钟，显微镜下控制显色。水洗，封片。3 3 结果判定：细胞呈现棕黄色者为阳性凋亡细胞。细胞凋亡指数的计算：每张切片各选择3 个视野，在1 0 0 倍视野下计算凋亡细胞数
6、占细胞总数的百分比，即细胞凋亡指数( A p o p t o t i cI n d e x ，A I ) ，组间比较。4 流式细胞仪P I 标记法。4 1 原理：细胞凋亡时D N A 可能因漏出而减少，在流式细胞仪P I 染色的细胞D N A 直方图上，G 1 期的前面有亚G 1 峰，也就是凋亡细胞峰。4 2 方法：胰酶消化细胞；1 0 0 0 转分，离心5 m i n s ，加入1 5 m l P B S ，吹打；加入一2 0 。C 无水乙醇2 m l 打散：应用流式细胞仪记录激发波长4 8 8 n m 处的红色荧光，输入计算机运用M O DF I T L Tf o rm a c1 1 8巾
7、华中医药学会骨伤分会第叫届第一次学术大会论文汇编v l 叭和C E L L Q U E S T 软件分析细胞摘亡的自分率，缃m 】进行比较，并以A 打刚的形式打印。5 统计学方法S P S S 统计软件包1 00 ，进打平均值比较单幽素方差分析。 结果l 光镜观察：凋亡的细胞外形不规则，桉膜皱缩、内陷细胞质浓缩细胞器少且不可辨认，并有较多卒泡结构，可见凋亡小体形成( 罔1 ) 。 燃圈12T U N E L 法观察：埘照目l 椎州艟中嗣【1 。细胞( 细胞内有棕黄色颗粒) 较少，摸型纽捌亡细胞数多( 圈2 ) 。2 0 u 删A 组0 0 u 姗z 如组5 0 0 u W 的H ：啦组1 E
8、常组中华中医药学会骨伤分会第四届第二次学术大会论文汇编组别流式细胞仪P I 法( ) T U N E L 法( 诱导凋亡各组同正常组纤维环细胞比较，为P O0 5 ，“为P O07 06 05 0社4 0 U 痒3 0Z O1 00图3流式细胞仪P I 法( ) T I J N E L 法( )正常纤维环细胞2 0u M1 1 2 0 2口1 0 0u M 的H 2 0 2口5 0 0u M 的H 2 0 2讨论体内和体外研究都证实过度的椎间盘细胞的凋亡是椎间盘遇变的主要病理变化”“。因此，调控椎间盘细胞的过度凋亡可能是个治疗推问盘退变的有效措旄。凋亡是细胞对环境的生理性病理性刺激信号，环境条
9、件的变化或缓和性损伤产生的由基因控制的细胞自主的有序的死亡过程。在凋亡进程中有两条信号通路：一个是细胞表面的死亡受体通路，另一个是线粒体途径。凋亡细胞及组织的变化与坏死有明显的不同。形态学观察细胞凋亡的变化是多阶段的细胞碍亡往往涉厘单个细胞，即便是- - d 部分细胞也是非同步发生的，首先出现的是细胞体积缩小连接消失，与周围的细胞脱离，细胞质密度增加胞浆浓缩内质阿扩张成泡状并与细胞膜融合核质浓缩，密度增高呈半月形并凝聚在核膜周围，核膜校仁破碎，D N A 降解成为约1 8 0 b p - 2 0 0 b p 片段：胞膜有小泡状形成，膜内侧磷脂酰丝氮酸外翻到膜表面胞膜结构仍然完整，最终可将蔼亡细
10、胞中华中医药学会骨伤分会第四届第二次学术大会论文汇编遗骸分割包裹为几个凋亡小体，无内容物外溢，因此不引起周围的炎症反应，凋亡小体可迅速被周围专职或非专职吞噬细胞吞噬。椎间盘的生理正常情况下，椎间盘内压力明显高于动脉压，髓核内部氧分压极低或者属于无氧环境，髓核细胞很少使用氧，而且很少制造C O z ；它们大部分以三磷酸腺苷( A T P ) 形式存在的能量通过糖酵解由葡萄糖到乳酸的转变来获得。细胞外氧浓度和P H 水平影响基质合成和降解率，基质合成率在大约5 的氧时呈现最高，比在正常空气中( 2 1 氧) 的合成率还高。在没有氧存在的情况下，椎间盘细胞可以存活很多天哺。7 1 。在较高氧和p H
11、 情况下基质合成降低或许因为椎间盘细胞不需要高浓度氧环境，不能清除高氧条件下产生的活性氧( R e a c t i v eO x y g e nS p e c i e s 。R O S ) C S 。引起椎间盘细胞凋亡的诱导因子，一般认为非生理性负重在椎间盘退变的病理过程中起重要作用，会引起椎间盘细胞的过度凋亡 9 - z o ，一些生化刺激如高脂质过氧化水平可诱导或提高椎问盘细胞凋亡1 。体内大部份自由基是在线粒体内部产生的，线粒体和线粒体膜是首先受到自由基攻击的细胞结构。自由基氧化线粒体膜上的不饱和脂肪酸，造成脂肪过氧化、脂肪分解、膜破裂等一系列无法修复的损伤，这种损伤最终导致椎间盘细胞凋
12、亡。本研究采用H 2 0 z 诱导体外培养纤维环细胞，进行氧化损伤对纤维环细胞的定量分析，发现H 。0 2 诱导纤维环细胞凋亡率与正常纤维环细胞相比明显增高，定量分析了诱导凋亡细胞凋亡的程度，明确了不同浓度H 2 0 z 作用下纤维环细胞的凋亡率的变化。证实了采用H 2 0 ：诱导纤维环细胞凋亡的可行性，统一观察了指标，建立了一个用于椎间盘纤维环细胞机理研究的模型。补肾和柔肝中药对C 5 7 黑鼠膝骨关节炎滑膜中C O M P 基因表达的影响。上海中医药大学附属曙光医院石关桐韩大鹏郑昱新曹月龙张鹏武娜以往认为骨关节炎( O s t e o a r t h r i t i s ，O A ) 是一
13、种以关节软骨退变为特征的慢性关节疾病，所以较多的研究仅着眼于对骨关节炎中关节软骨的研究，但在O A 的早期，滑膜的增生和纤维化，分泌炎症介质和软骨降解酶，可能是o A 发病的重要闪素，随着0 A 的进一步发展，滑膜始终参与其病理过程。而临床上应用补肾和柔肝中药取得了满意的疗效，本实验主要从C O M P 表达水平着手，观察补肾和柔肝中药对其表达的影响，以期为中药治疗骨关节炎提供理论基础。1 材料与方法1 1 药品与试剂密骨胶囊( 沪药制字：Z 0 4 1 0 0 6 1 5 ，主要成分：制何首乌、淫羊藿等) ，养血软坚胶囊( 沪药制字：Z 0 5 1 0 0 9 3 2 ，主要成分：白芍、秦艽
14、、牡蛎、全蝎、蜈蚣、甘草等) ，均由上海中医药大学附属曙光医院药剂科生产。芬必得，中美天津史克制药有限公司生产( 批准文号：国药准字H 1 0 9 0 0 0 8 9 ，生产批号：0 5 0 5 0 6 4 4 ) 。小鼠C O M P G A P D H 引物，上海生工生物工程技术服务有限公司提供。A M VR e v e r s eT r a n s c r i p t a s e ，由P r o m e g a 公司提供。R e v e r T r aA c e ，r T a q 酶，由T O Y O B O公司提供。D N AM a r k e r ，由北京鼎国生物技术有限公司提供。1 2 动物分组与造模将7 周龄S P F 级成年C 5 7 黑鼠兄妹交配繁育，所得第三代健康黑鼠6 0 只，雌雄各半。随机分为空白组、模型组、补肾组、柔肝组、芬必得组，每组1 2 只，雌雄各半，雌雄分开喂养。除空白组外，其余4 组参考文献方法造模心1 。在电动跑台上进行1 周的适应性训练后，每天进行一次行走训练( 8 l O m m i n 5m i n ) ，每周5 次，连续4 周。所有实验用C 5 7 黑鼠，由上海中 基金项目国家自然科学基金资助项目( 3 0 4 7 2 2 2 2 )1 2 l
