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1、海峡两岸中医药发展大会C r o s s S t r a i tC o n f e r e n c eo nt h eD e v e l o p m e n to fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e中药干预线虫帕金森病模型的分子机制思路分析王香明王丹巧中国中医科学院医学实验中心北京1 0 0 7 0 0一、帕金森病简介帕金森病( P a r k i n s o n 7 S d i s e a s e ，P D ) 是一种黑质纹状体系统多巴胺( d o p a m i n e ，D A ) 神经功能受损所致多巴胺与乙酰胆碱平衡失调
2、的一种慢性疾病，以运动迟缓、静止性震颤和强直为主要特征。病程呈进行性发展，随着年龄的增长，患病率逐渐增高。其病理改变主要涉及中脑黑质D A 能神经元缺失，残存的神经元变性，胞浆内出现特征包涵体( L e w y d x 体) l l J 。二、现代生物学和医学对帕金森病发病机制研究进展近年来由于现代生物学的发展及模式生物被引入帕金森病的研究中来，关于帕金森病的分子机制有了新的认识【2 引。1 、线粒体功能缺陷在P D 发病中的作用：线粒体呼吸链是体内氧自由基产生的主要部位，呼吸链中任何部位受到抑制都可能会使自由基产生增多。从而破环细胞内核酸，蛋白，脂类等大分子，从而导致细胞死亡。2 、氧化应激
3、学说：近年来生化分析研究发现，P D 病人黑质致密区内铁水平增高，铁代谢紊乱，过量铁作为一种神经毒素诱发了氧化应激，生成细胞毒性的羟自由基，继而引起膜脂过氧化等一系列氧化损伤，最终导致了细胞死亡。3 、细胞凋亡学说：为探讨细胞凋亡在P D 发病机制中的作用，科学家做了大量的研究。结果表明P D 可能是在多种因素的作用下通过一条共同的最后通路，即细胞凋亡而致。4 、发现大量和帕金森病相关的基因，如：o c - s y n u c l e i n ，P I N K l ，D J I ，U C H L l ，P A R K 2 ，L R R K 2 ，线粒体相关基因，泛素蛋白酶体通路，溶酶体相关基因
4、，膜泡运输相关基因等，对帕金森病发病分子通路有了更进一步的了解1 4 1 。总之现在帕金森病研究热点集中在其发病的分子机制方面。三、秀丽隐杆线虫( C a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，以下简称线虫) 在抗帕金森病研究中的优势直接以人为研究对象来研究帕金森病及抗帕金森病药物由于受到伦理、取材( 一般只能取血，尿等) 以及样本量的限制而难以开展。所以人们选择了猴、狗、大鼠、小鼠、果蝇等模式生物【五B7 1 。以大鼠，小鼠等哺乳动物为研究对象有其自身优势，因为在进化上比无脊椎动物更接近人，获得的研究成果相对容易应用于人。但是大鼠，小鼠等也有一些不利于研
5、究分子机制的地方：I 饲养条件高，成本大；世代周期长，需要更长的研究周期；I I I 样本量相对较少；采用药物造模的不同动物之间存在个体差异，而遗传模型价格昂贵；v 神经细胞在脑颅内，不易直接观察；分子通路研究不及无脊椎动物清楚。V I I 帕金森病发病机制复杂，以大鼠，小鼠等高等生物研究分子机制在实验设计，操作，分析等方面较难进行，有必要先应用较为简单，易于操作的模式生物。所以我们选择线虫为模式生物来研究中药干扰帕金森病的分子机制。首先，线虫具有以下优点使得其十分适合作为研究帕金森病的模式生物【8 】：I 易培养，廉价：I I 世代周期短，适合快速观察实验结果：后代数目多，适合统计分析；分子
6、遗传技术成熟；V 细胞谱系清楚，线虫共有8 个多巴胺神经元f 9 1 ，4 个c e p h a l i cc e l l s ( C E P s ) ，2 个a n t e r i o r d c i r i d s ( A D E s ) ，2 个p o s t e r i o r d e i r i d s ( P D E s ) ，可以通过转基因G F P 显示出来( 图1 ) ：V I 身体透明，可以很清楚的在显微镜下观察活体的结构；V I 也是最重要的，线虫和人在基因和分子通路方面保守，比如在线虫中首先发现的细胞凋亡通路，R N A i 通路在高等生物中保守在神经系统方面大部分在哺
7、乳动物中D A 信号通路的基因和线虫中的保守，如c a t - 2 ，c a t - 4 ，d a t - I 等。基因组比对发现，线虫在以下基因组成方面与哺乳动物保守 9 1 ：离子通道，神经递质合成酶( 包括酪氨酸羟化酶T H ，芳香族氨基酸脱羧酶A A A D 等) 突触囊泡和突触前蛋白( 包括s y n t a x i n s 。s y n a p t o t a g m i n ，s y n a p t o b r e v i n ) ，神经递质受体( 包括谷氨酸，乙酰胆碱，G A B A ，神经肽等) ，神经递质转运体( 如乙酰胆碱转运体V C h A T ，多巴胺转运体D A T
8、 等) 。V I I I 适合大规模，高通量筛选药物。线虫中许多遗传通路研究相对清楚。另外以线虫为模式的帕金森病模型也已经建立，并且已经显示了在该病分子机制方面研究的优越性( 发现很多新的和帕金森病相关的基因) 。2 0 0 6 年K u w a h a r a 等人在线虫多巴胺神经元中特1 8 2塑塑些! 唑! 些! 些堡业P ! 型蓝翟篓望鲨异过表达野生型或雍空型( A 3 0 P - A 5 3 T ) 人* s y n u c l c m 基目，造成线虫多B 胺神经R 特异性功能损伤“自多E睦神经元控制的对食物反应下降，并且多B 胺神经元神经突起坏死( 圈1 ) ，从而引起多B 胺分泌
9、减少。行为学上的缺陷可以通过应用多B 胺而得到理解显示T 和人帕金森病的相似性。2 0 0 6 年V a , r “n e n 等人应用过表达人m s v c l 由基因践虫品系进行基目芯片分析发珥4 3 3 十基目E 调和6 7 个基目T 调。其中7 个在泛静蛋白酶体系统茇挥功能韵基目( t ，e 口- 】，u k 一7 ，p a s 一5 ，p - 7 ，曲“R P T 2 ，P S M l 2 9 ) 表选r 调3 5 十在线赫体中熊挥功能的基因上调【I ”。2 瞄年K u w 山n 等人应用过表选人* s ”】咖基因线虫品系对1 6 7 3 个基因进行R N 舡筛选，筛选到1 0 基园
10、可以特异性的在转基因品系造成运动障碍其中包括和胞眷通路相关的四十基园( 叩a - 2 ，”s 0 ，郴& t a b - 7 ) ，显示 了胞吞通路和帕盘森崭的相关性”“。总之以过表达 州n u c l e m 基目缱虫品系为模型研究帕盘彝病麓病机制B 经取得了可喜的成绩，显示丁线虫在研究帕金森病盈药物抗帕金森瘸分子机制的优越性。( 圈1 选自K u w h a d dJB i o l 西e m2 0 0 6 ，2 8 1 3 3 扯，4 0 )A 、野生型线虫 羟色胺神经元( 箭头所示) 和多E 胺神经( j 角所示) 部完好无损C 、转摹日 a - s y a u e l m线虫五羟色胺神
11、经元( 箭头所示) 完好无损而多E 胺神经元( 三角所示) 特异性损伤。B 和D 为对应线虫在晴场下的鼎片。硼，中蒴千强帕盘耘丹予帆誓旰兜方法从分子生物学术平研究中药药4 E 经取得了一定的进展如在抗衰老癌症等中药的研究中。对中药在抗帕盘森病中的分子机制7 解相对较少而阐明丹子机制是从根本t 了解中药发挥功能的基础，具有m 耍性和紧迫性：1 、拄到中药抗帕金森病的分子靶标可阻帮助人们4 解帕金森痛的致病机4 E 如发现某基因在用药后表选升高，剥暗示可能是由于该基因表选不足导致T 帕金森病反之亦然。2 、找到中药抗帕金森扁扮丹于靶标图谱可以为进一步的药物筛范提供分于依据为获得高效抗帕金森病中药或
12、复方服务。3 、彻底阐明中药抗帕金森病的有效成分和分子机制有利于促进中药的现代化和国际化。前立升绍了线虫研究帕金森病分子机制的优势以盈探壹中药发挥功能分子机制的重要性T 而介绍应用线虫研究中药干预帕盒森病分子机制方法。在荧光显微镜下根容易观察线虫帕盒森病转基因品系多B 胺神经树突减少( 圈1 ) ，非常适台筛选到日以对多E 胺神经元树究发挥保护功能的中药进而研究其分子机制。具体方法是采用不同浓度中药干预线虫帕金森病转基凼品系，和对照对比寻找可阻恢复或部分恢复多E 胺神经树完形态的适合浓 度中药。觥到合适浓度中药后井以此浓度下预缱虫收集线虫提取R N A 分别进行定量F C R 和基因芯片检测寻
13、找中药干预线虫帕金蠢存舟子靶点获得候选靶点后进行遗传检测，口订购相应基因臭变或过表达品系，并用相应中药干预这些突变体氍寨是i 仍具有十预线虫帕盘森病模型的功能咀判断靶点的真实性。中药千疆帕盘黼舟于机研究蠢程巡墨篓釜簋些型，型型型些。型! 。 鞲幽譬嶙I 浓度梯焉复曼皇扫一嘲爰蔓曼蔓奢一药理检测总之，线虫作为个研究分7 机制极好的模式生物，自经在帕盘森病发病机制研究中发挥T 重要作用中药在抗帕盘森病方面也显，较好的前景两者的有机结合必将在中药抗帕金森宿分子机制研究中大显身手。女t# # 月f * i 自# # n d 十目黝自0 ，2 0 0 4 ，4 ( 7 ) l ”糨* * * 女镕- 十
14、# 镕* ，2 叫 3 1 p * * * * * 女黼n d & # * 镕口m R m * 目* * # * * 0 0 口63 3 ( 2 ) l q h 呲M J 2 嘶) - 曲础口o f ，枷d i s e m t ：口“岍蛐a d l u ”咿5 P N a R e v ( 4 ) 1 8口】矍均，# t * 女* 自# # 目R * 黾十目# E * 2 螂1 i ( 2 )H 一- vp ，w 目删d K Hm 吼 “蛐“r 口p 山。蛔。删h 珊I 山h5 ”s c l2 。D 0 - 赴6 0 2 l 6 0 口9 1 7 I y M B c n 虹W w 【2 咖) A
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16、h a r a , T A K o y a m a , e t a ( 2 0 0 6 ) F a n l i l j a lP 越 k i R s o lm u t a n ta l p h a - s y n u d e i n 俐s 鼯d ) p a m i n c 删d y s f u n c t i o ni n 把a n s g e t d cC a e n o r h a b d i t i se l e s a n a JB i o lC h e m2 8 1 ( 1 ) ：3 3 4 - 4 0 1l l V a r l i a i n e n , S ，P P e h k o n e n , e to ( 2 0 0 6 )
