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1、中山大学博士学位论文Survivin在糖尿病小鼠胰腺中的表达及其过表达对NIT-1细胞凋 亡的影响姓名：徐明彤申请学位级别：博士专业：内科学指导教师：程桦20060504S u r v i v i n 在耱尿病小鼠胰腺中的表达及其过表达对M T 1 细胞凋亡的影响中文摘要S u r v i v i n 在糖尿病小鼠胰腺中的表达及其 过表达对N I T - 1 细胞凋亡的影响专业：内博士生：徐导师：程科学明彤桦教授摘要众多的研究结果支持胰岛B 细胞缺陷在糖尿病的发生发展中起重要作用，是两型糖尿病的共同发病基础。较为明确的是：胰岛B 细胞发生细胞介导的自身免疫反应性损伤是1 型糖尿病的主要病理改变
2、。2 型糖尿病患者也存在不同程度的1 3 细胞功能受损。研究显示，从葡萄糖耐量正常到葡萄糖耐量减低再到糖尿病，胰岛素分泌受损起了决定性的作用。病理学研究表明2 型糖尿病患者存在D 细胞凋亡，是6 细胞块减少的主要原因。探索胰岛保护的研究主要包括：给机体注射某细胞因子的抗体或导入细胞因子拮抗剂基因拮抗细胞因子；寻找具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖作用的生长因子或激素，导入抗凋亡因子、或抑制凋亡信号通路中的基因等。但迄今仍未能发现有效遏制各种诱导因素导致6 细胞凋亡的切入点。S u r v i v i n 是近年发现的抑制凋亡和调节细胞分裂的蛋白质，是抗细胞凋亡蛋白( i n h i b i t o
3、 ro fa p o p t o s i s ，l A P ) 家族的成员。S u r v i v i n 在人胚胎组织及组织生长发育过程中表达，在大部分分化成熟组织中丧失表达，而在多种恶性肿瘤中s u r v i v i n 表达上调，并伴随明显的凋亡抑制。不同的研究均证实s u r v i v i n 能强烈地抑制凋亡，并在细胞的有丝分裂中起重要作用。进一步研究提示s u r v i v i n 可通过直接或间接作用于c a s p a s e 级联而实现对细胞凋亡的抑制。晚近的研究发现s u r v i v i n 在组织器官的损伤修复中起一定的调节作用。D e g u c h i 等在
4、小鼠肝脏损伤一再生模型中发现肝脏再生时s u r v i v i n 的表达上调。T a s h i r o 报道牛磺胆酸钠诱导的急性出血坏死性胰腺炎大鼠模型中，s u r v i v i n 的表达在胰腺外分泌腺的再生中起一定的调节作用。此外，多个研究在血管、胃粘膜、S u r v i v i n 在糖尿病小鼠胰腺中的表达及其过表达对N T _ l 细胞捌亡的影响中文摘要心脏和脑组织中均支持s u r v i v i n 表达上调参与组织损伤后的修复与再生。E x e n d i n 一4 ( E x ) 是毒晰属动物唾液腺分泌的蛋白质，与哺乳动物小肠L 细胞分泌的g l u c a g o
5、 n - l i k ep e p t i d e 1 ( G L P 一1 ) 有5 3 的同源性。E x 能与G L P 一1 受体结合，从而发挥与G L P 1 相近的血糖调节作用。研究显示G L P 一1 受体信号途径激活可促进胰岛B 细胞增殖、促进导管上皮或胰岛内的潜能干细胞分化为B 细胞，另有研究表明G L P 1 受体信号途径可抑制B 细胞凋亡，而介导其抗凋亡作用的机制尚未完全明了。综上所述，提出本研究的主要目的：1 探讨s u r v i v i n 在链脲佐菌素( S T Z )诱导糖尿病小鼠模型胰岛修复与再生中的作用；2 观察E x 对S T Z 糖尿病小鼠胰岛s u r
6、v i v i n 表达的调节作用；3 探讨s u r v i v i n 基因过表达对小鼠胰岛素分泌细胞系N I T - l 细胞凋亡的影响；拟从在体和离体的角度研究s u r v i v i n 是否对胰岛存在保护作用。研究内容分为两部分：研究S T Z 诱导糖尿病小鼠模型胰腺s u r v i v i n 基因的表达情况；同时给予S T Z 小鼠E x 处理，了解E x 对s u r v i v i n 表达的影响以及s u r v i v i n是否与E x 抗凋亡有关。另一方面，利用分子生物学技术，将s u r v i v i n 基因导入胰岛素分泌细胞，使胰岛素分泌细胞高度表达s
7、u r v i v i n ，然后暴露于凋亡诱导因子的环境，以探求s u r v i v i n 是否具有保护胰岛素分泌细胞的作用。第一部分链脲佐菌素诱导糖尿病小鼠模型胰腺s u r v i v i n 基因的表达及e x e n d i n 4 对其的影响一、研究目的建立连续多次小剂量S T Z 注射诱导糖尿病小鼠模型，探讨S T Z 诱导糖尿病小鼠成模过程中的不同时间点胰腺s u r v i v i n 基因m R N A 的表达情况，并了解E x对其的影响。二、研究方法1 、实验动物分组与处理：6 周龄雄性B a l b c 小鼠稳定饲养l 周后随机分为三组：( 1 ) S T Z 组第
8、l 一5 天腹腔注射S T Z4 0 m g k g ，S T Z 注射前2 天始连续S u r v i v i n 在糖尿病小鼠胰腺中的表达及其过表达对N I T - 1 细胞凋亡的影响中文摘要l O 天腹腔注射生理盐水。( 2 ) E x 组第1 5 天腹腔注射S T Z4 0 m g k g ，S T Z 注射前2 天始连续1 0 天腹腔注射E x2 4n m o l k g 。( 3 ) 对照组注射溶剂。每周测量体重、随机血糖，并于各时段取胰腺组织，一8 0 。C 保存或4 多聚甲醛固定。2 、胰腺组织H E 染色、胰岛素和s u r v i v i n 的免疫组化检测3 、T U N
9、 E L 检测胰岛细胞凋亡4 实时荧光P C R 检测胰腺组织s u r v i v i n 基因m R N A 水平5 、R T - P C R 产物进行核苷酸序Y , J N 定。三、结果l 、小鼠体重、血糖的变化：对照组小鼠体重呈持续增加( P O 0 5 ) 。不同时间点的三组小鼠比较，处理前各组小鼠的体重差异无统计学意义( P 0 ，0 5 ) iS T Z 组第1 、3 、4 周体重均低于同龄的对照组( 尸 0 0 5 ) I第3 和4 周时E x 组的小鼠体重有高于S T Z 组的趋势，但P 0 0 5 。对照组小鼠血糖维持在稳定的水平( F = 0 8 3 l ，P = - 0
10、 5 1 2 ) 。S T Z 组小鼠血糖在第l 、2 、3 周呈进行性上Y I - ( P 0 0 5 ) ，继后的各个时间点中，S T Z 组和E x 组小鼠的血糖均高于同龄对照组( 户 O 0 5 ) 。S T Z 组1 、2 周s u r v i v i nm R N A 表达量与基础持平( 尸 0 0 5 ) ，第3 、4 周高于基础水平，也高于同时间点对照组水平，差异均有统计学意义( 氏O 0 5 ) 。E x 组s u r v i v i nm R N A 表达量在第2 周时无明显变化( P - - 0 9 4 ) ，4 周时升高，也高于同时期对照组和S T Z 组，差异均有统计
11、学意义f P 0 0 5 ) 。细胞因子干预的各亚组中，S U R - C 组低于C C 组( H o e c h s t3 3 3 4 2 染色示5 7 8 _ + 0 8 l v s1 0 6 9 + 1 3 5 ，P O 0 5 ) A tt h eb e g i n n i n g ，t h eb o d yw e i g h t so ft h r e eg r o u p sw e r en o ts i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n t( 尸 0 0 5 ) A tt h ee n do fI m ，3 r da n d4 1w e e
12、 k ，b o d yw e i g h t so fm i c ew e r eo b v i o u s l yl o w e ri nS T Zg r o u pt h a nt h a ti nt h ec o n t r o lg r o u p ( P 0 0 5 ) C o m p a r i n gw i t hS T Zg r o u p ，t h eb o d yw e i g h t so fm i c ei nE xg r o u ph a dat r e n dt oe l e v a t ea tt h ee n do f3 一a n d4 山w e e k b u
13、 tt h ed i f f e r e n c e sd i dn o tr e a c hs t a t i s t i c a ls i g n i f i c a n c ef | p 0 0 5 ) ，T h ec h a n g e so fb l o o dg l u c o s el e v e l sD u r i n gt h ee x p e r i m e n t ，s t e a d yb l o o dg l u c o s el e v e l sw e r em a i n t a i n e di nc o n t r o lg r o u p ( F = 0
14、 8 3t ，P = O 512 ) ，w h i l es u s t a i n e dh y p e r g l y c e m i ad e v e l o p e da f t e rS T Zi n j e c t i o ni nb o t hS T Za n dE xg r o u p 伊 0 0 5 ) I nt h eS T Zg r o u p ，i tW a sr e v e a l e dt h a tt h e r eW a sn os i g n i f i c a n tc h a n g ef r o mt h eb e g i n n i n gt ot h
15、 ee n do f2 “w e e k ( P O 0 5 ) ，b u ti n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya tt h ee n do f3 “a n d4 t “w e e ka n dW a sh i g h e rt h a nt h a to fc o n t r o lg r o u pm e a n w h i l e ( P O 0 5 ) A m o n gc y t o k i n ei n t e r v e n t i o ng r o u p s ，t h ep e r c e n t a g eo fa p o
16、p t o t i cc e l l si nt h eS U R - Cg r o u pw a sl o w e rt h a nt h a t i nt h eC Cg r o u pr H o e c h s t3 3 3 4 2 ：5 7 8 0 8 1 V S1 0 6 9 1 3 5 ，P 0 0 5 ) 。各时间点三组小鼠比较显示，实验开始时各组小鼠的体重无明显差异f 尸 0 0 5 ) ：S T Z 组小鼠在继后的第1 、3 、4 周中体重均显著低于同龄的对照组小鼠( P 0 0 5 ) 。第3 和4 周时E x 处理组的小鼠体重有高于S T Z 组的趋势，但未达到统计学的意义( P O 0 5 ) 。对照组小鼠血糖维持在稳定的水平( F = 0 8 3 1 ，P = 0 5 1 2 ) 。S T Z 组小鼠血糖在第l 、2 、3 周呈进行性上升，及至第4 周水平与第3 周接近，差异无统计学意义(
