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1、实验准备实验准备一人外周血单核细胞分离1. 抗凝血的抗凝血的预预离心分离心分别别取正常人新取正常人新鲜鲜抗凝全血抗凝全血A: 20 mL于50 mL离心管中，以2 000 r /min离心20 min，吸弃上层血浆，获得下层沉淀细胞约1012.5 mL。2. 沉淀沉淀细细胞的稀胞的稀释释与离心分离在所与离心分离在所获获取沉淀取沉淀A 中的细胞中加入Hanks液( 不含Ca2+、Mg2+, pH 7.2 7.6) 体积比仍未1:1，混匀，制成细胞悬液。B: 无菌抗凝血与Hanks液或PBS以1:1体积在试管中混匀。另取一离心管，加入LTS1077淋巴细胞分层液，然后用毛细吸管距分层液上1cm处将
2、细胞悬液小心而缓慢地加于其上面，使稀释血液重叠于分层液上。此时稀释后的细胞悬液分离液淋巴细胞体积为：1:1。与用水平离心机以2000 r /min 离心20min，离心结束后，取出离心管，可见管中液体已经分层。管内可见分为4层：最上层是血浆，含部分血小板：第二层为薄薄的白膜层，主要台单个核细胞，还混杂有少量血小板；第三层为分离液层；第四层为粒细胞及红细胞，红细胞沉于管底，而粒细胞则紧贴在压积红细胞上呈一层很薄的白膜(图213)：3.单单个核个核细细胞的提取、洗胞的提取、洗涤涤与与悬悬浮、浮、贴贴壁壁 吸去最上层的血浆，收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞，尽量全部吸出PBMC。加34倍
3、以上体积Hanks或PBS液于所得的单个核细胞中，用毛细吸管轻轻吹判均匀，避免产小气泡，液柱高度不超过离心管的23。混匀后离心1500r/min离心10min，低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板，去上清液。注意：还可以先用吸管把雾状层上面的液体吸走，注意不要碰到雾状层，然后在把要的部分慢慢吸出来。第二种方法，比较简单一些。再用同样洗涤液洗涤细胞2次，1500r/min离心10min，洗去残留的淋巴细胞分离液。再以RPMI-1640 培养基离心洗涤1次，吸尽上清，以充分去除血小板等杂质。按每毫升血液标本加0.2 mL含20%小牛血清的Hanks液( 或含10%胎牛血清及25 mmol /L hepas的RPMI-1640液34 mL) 重新混悬细胞37、5% CO2孵育箱中培养2 3 h后去除上清，得到贴壁的单核细胞。于各培瓶中分别加入含10%胎牛血清的RPMI-1640液34 mL，按需调定细胞密度, 于37、5% CO2孵育箱中培养备用。4.单单核核细细胞的胞的纯纯度与度与细细胞活力的胞活力的鉴鉴定定 取一定体积的细胞悬液送做流式细胞CD14、CD56 等检查,以测定所得细胞的纯度。取1 滴细胞悬液置于血细胞计数板内计数。以台盼蓝拒染法检测细胞活力。取1滴细胞悬液加1 滴2%台盼蓝染液混匀，加盖片，显微镜高倍镜检，活细胞不着色，折光强；死细胞被染成蓝色，体积略膨大。
