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1、N A N T O N G H E P f T O B I L l A R Y & P A N C R E A T I C S U R G E R YF o R U M铴I 念2 0 0 9 国际肝胆胰9 l 科南通论坛I 璧第二十二届呈国肝胆胰9 k 科学7 f t 经验交流会不同断流术式对门静脉高压症犬胃粘膜细胞凋亡的影响陈钟单志祥明志祥戴向华朱李珞南通大学附属医院普外科门奇断流术是治疗门静脉高压症食管下段静脉曲张破裂出血( E V B ) 的常用术式i 1 ，2 】。但有研究显示，断流术后会加重门静脉高压性胃病( P H G ) ，而P H G 是肝硬化门静脉高压患者的另一重要出血原因。
2、我们通过对肝硬化门静脉高压症模型犬行3 种不同的门奇断流术式，采用原位末端脱氧核苷标记法( T U N E L ) 染色测凋亡指数( A J ) ，C a s p a s e 3 免疫组化计算各染色强度细胞评分总和( H 值) ，观察术前、术后6 月的胃粘膜细胞的凋亡情况，探讨不同断流术式对P H G 的影响。材料和方法1 一般资料：杂种犬2 4 条，雄雌各半，体重8 1 0k g ，平均9 6 k g 。采用皮下注射6 0 四氯化碳联合喂养猪油拌饭及饮食控制8 1 2 周后制成肝硬化门静脉高压症模型。模型建立后1 周，将模型犬随机分为四组，每组均为6 例：A 组行贲门周围血管离断术；B组行选
3、择性贲门周围血管离断术；C 组行选择性贲门周围血管离断加经腹吻合器食管下段横断吻合术；D 组即对照组，行开关腹。2 手术方法：所有犬以3 戊巴比妥钠1 m l k g 静脉麻醉。上腹正中切口进腹，A 、B 、C 组切除脾脏后，从胃体中部开始向上，紧贴胃、食管壁切断和结扎胃大、小弯侧、贲门周围及食管下段3 - 4 c m 范围内所有进入胃壁和食管壁的血管。A 组切断冠状静脉主干，B 、C 组保留冠状静脉主干，仅切断、结扎其进入胃及食管的分支。游离食管过程中，切断迷走神经干。C 组在距贲门约3 c m 左右切开胃体前壁约2 5 c m ，置入2 4 号吻合器，在贲门上方2 3 c m 处用丝线将食
4、管壁捆扎在吻合器主体与砧体之间，击发吻合器，切除一小段食管壁并同时完成吻合，再用闭合器关闭胃壁切口。D 组为对照组，采用单纯开关腹【3 】。所有犬均在术中及术后6 个月取胃底部胃壁组织，用1 0 甲醛同定，石蜡包埋。3 观察项目：( 1 ) 一般情况观察犬的存活情况，精神状态，活动度，饮食等。( 2 )模型犬门静脉直径、血流速度和肝脏病理术前采用彩色多普勒超声检测模型犬门静脉直径和血流速度。术中观察肝脏肉眼变化，并切取小块肝组织活检，用1 0 甲醛固定，石蜡切片，H E 染色，光镜下行组织学检查。( 3 ) T U N E L 法检测胃粘膜细胞凋亡：细胞凋亡检测试剂购自武汉博士德生物工程有限公
5、司。检测结果判断：细胞核中染色有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞。每张切片在4 0 0 倍镜下选择对照背景好、细胞分布较均匀的1 0 个视野，每个视野计数1 0 0 个细胞，共计1 0 0 0 个细胞，计算出每张切片上的阳性细胞百分数即细胞凋亡指数触。( 4 ) 胃粘膜细胞c a s p a s e 一3 蛋白免疫组织化学染色：多克隆抗体C a s p a s e 一3 试剂购自武汉博士德生物工程有限公司。细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞，每张切片随机选l O 个4 0 0 高倍视野。计分标准采用半定量计数方法：按染色强度将阳性染2 9 国际肝胆胰外科南韪论坛 鐾第二十二届呈国肝胆胰外科学术经验交
6、濂盆感萋色分为弱( 淡黄) 、叶 ( 黄) 、强( 棕黄) 二等，分别训为1 、2 、3 分，尤染色计为0 分，并汁算m 阳性细胞数l 。同类训数圳胞的卣分比。根据公式计算m 每张染色切”的H 值 4 。( i ：染色强度，计分为1 、2 、3 分：P 1 ：阳陛细胞所i I - 百分比：H ：各染色强度细胞评分总和) 。H 值范围为0 4 0 0 分，0 分表1 i 所自细胞均无蛋白表达( 即为阴降) 4 0 0 分表示所有细胞均呈强卧陀裘哒，0 4 0 0 分之问代表着小刊程度的蛋白表达水平。训算公式如下：3H = ( 1 + 1 1 x P i4 统计学疗法：所有数据均咀均数l 。标准差
7、( o 一) 表H i ，采用s t a t a 80 统计软件进行分析，T U N E L 法榆测胃精膜细胞捌产所测得的A I 值，两组问比较进行t 检验，多组问比较采用办差分析；c a s p a s e 一3 蛋白免疫组织化学染色所删得的H 值，采_ L 】多个样奉( K r u s k a l - W a l l i s ) 及两个样奉( W i l c o x o n ) 比较的秩和榆验。 结果I一般悄况：各手术组犬的手术过程均顺利。所有犬均存活至术后6 个月。A 、B 、c 组与D 组比较，术扁早期精神状态较茸，i 动较少，但术后1 周各纽硅芹异尤统汁学意义。所有动物术后2 d 内
8、禁食期问于静脉滴汁补充液体、能晕，术后第3 d 开始了流质饮食，第5 dr 半流质饮食，1 州后即予普食，2 刷后饮食龟与术l 讨差异无统训学意义。2 模刑犬门静脉直径、血流速度和卅脏病理：模蛆开始1 2 周时，fJ 静脉直径从造模前的( 51 O3 8 ) m m 增加到( 64 1 05 7 ) m m ( P O0 5 ) 。A 组术后6 I l _ jA I 值为( 2 02 2 + 22 0 ) ，与术前比较明显增高( P O 0 5 ) ( 图6 ，7 ) 。D组术后6 月灿值为( 1 4 3 5 1 4 0 ) ，与术前比较差异无统计学意义( P o 0 5 ) 。与D 组比较，
9、术后6 月A 组A I 值增高，B 组减少( P 均 0 0 5 ) 。详见表1 。 表l 各手术组手术前、后胃粘膜细胞A I 值( i s )注：与术前相比，+ P O 0 5 ) 。A组术后6 月阳性细胞显著增多，且染色程度加深，呈棕褐色，有时呈颗粒状，H 值为1 1 3 7 8 1 9 8 0 ，与术前相比明显增高( P O 0 5 )( 图1 2 ，1 3 ) 。D 组术后6 月H 值为5 2 9 3 1 3 7 7 ，与术前比较差异无统计学意义( P o 0 5 ) 。与D 组比较，术后6 月A 组H 值增高( P o 0 5 ) 。详见表2 。表2 各手术组手术前、后胃粘膜细胞c
10、a s p a S c 3 蛋白H 值( i S )注：与术前比较，P 0 0 5 ；与D 组比较P O 0 5讨论门静脉高压症患者P H G 发病率的报道差异较大，占门静脉高压症患者的4 9 8 P l 。这种差异可能与患者选择、缺乏统一标准和应用不同的分类方法有关。门静脉高压症上消化道出血中，约1 0 “ - - 5 0 患者并非由食管胃底静脉曲张破裂引起，而是来自于P H G l 6 1 。而且P H G 引起的出血在初次出血后1 年内的再出血率高达6 2 ，5 年累计出血危险性为7 5，3 5 的轻度P H G 患者和9 0 的重度P H G 患者有明显上消化道出血史1 7 1 。由此
11、可见，P H G出血的临床重要性丝毫不亚于食管静脉曲张破裂出血。6 2G C M研盯肌M 舡mA CrN N U裟刺& Nw 乳MUBD1wE2 9 国隔肝胆胰外秽南厦论坛 暨第二十二届呈国肝胆胰外科学7 | c 经验交稚舍孳誓巴。：， 7 黪f ：。：；、 奠意。1 - 。、，心。躐落。鬣蕊攀，囊。名f 蔓0 ，t _ 夕f j、p ，t ，“。4 _ l ：凝0 氧H 1 0 B 组 l 】订W 牯日c - 3 m 甑4 0 0 )煳1 1B 组m n l # 腆胜c 唧a - 3 染色H 0 0 南。：，警- j 啊一。pX ；! 乏J 。，蠢：誊I 警、 ：! ， 7 ：、毒：一。 多
12、 ；1 i I | !：k 支r ，m ， ，竣r 爹1k 、。、7 巴鸯：书巍?P H G 的发病机制目前尚不完个清楚，f i 呵以泞定的是门静脉压力丁卜高是P H G 发牛的聃要因素1 8 ”，而设法降低fJ 静脉压力可改普P H G 0 。n o项研究表明，通过肝静脉压力梯度的直接测定罹小重型P H G 忠者静脉压力相对更高，绎过T I P s 治疗或外科分流术后P H G病情明显改善甚至消失也表明了与门静脉高压的重要芙系。引起P H G 的可能病理机制为：&NANTONGl-117PATOBILIARYP A N C R E A T I CI ，游&拶”接j驯硒劂m 则M 蟛2 0 0
13、 9 国际I t ：1 ：1 1 旦i 1 1 1 1 t I 科南通论1 云 暨第二十二届呈国肝胆胰外科学7 f c 经验交流舍门静脉高压时，虽然门静脉高压的高动力循环使胃的总血流量增加，但这种总血流量增加只是粘膜下层、肌层和浆膜层的血流相对增多1 6 , 1 3 1 ；同时门静脉高压时胃血流缓慢，胃粘膜下静脉及毛细血管阻力性扩张、瘀血，使氧和营养物质输送到粘膜的时间延长，代谢产物不能被及时带走，胃粘膜微循环障碍，对毒素物质易感性增高，受损害的胃粘膜层丧失了适应性调节局部血流的能力，导致胃粘膜层血供降低，粘膜有效循环血流量减少，粘膜上皮细胞供氧不足和启动细胞凋亡信号的一氧化氮和肿瘤坏死因子等
14、多种血管活性物质合成增加【1 4 1 ，通过一系列信号转导及C a s p a s e 家族间的级联放大作用，激活细胞凋亡的关键蛋白水解酶C a s p a s e 一3 ，降解胃粘膜上皮细胞中的多种C a s p a s e 一3 作用底物，如角质蛋白、肌动蛋白和层粘连蛋白等，使细胞凋亡增加，粘膜屏障受到损害【“ 1 。本实验的目的就是要通过采用T U N E L 法和免疫组化染色检测肝硬化门静脉高压症犬行不同断流术式后胃粘膜细胞凋亡的阳性率和C a s p a s e 一3 的表达程度，来推断三种不同的断流术式，即贲门周围血管离断术、选择性贲门周围血管离断术和选择性贲门周围血管离断加经腹吻
15、合器食管下段横断吻合术对P H G 的影响。有文献报道贲门周围血管离断术可加重P H G 。本实验中，A 组犬术后6 月A I 值及H值增加，表明术后犬胃粘膜细胞的凋亡加剧。这是因为贲门周围血管离断术后仍存在门静脉高压状态，脾胃区的淤血状态并未改善，加上手术结扎了贲门胃底周围血管，使该区域胃静脉回流进一步受阻，导致胃粘膜有效循环血流量进一步减少，从而加重胃粘膜细胞凋亡，加重了P H G 。近来国内有学者【l6 1 提出了选择性贲门周围血管离断术的理念，即主张保留食管旁静脉和胃冠状静脉主干，而逐一切断食管旁静脉进入食管下段的穿支静脉，该术式主要依据食管下段与胃贲门区的静脉解剖特点而设计的。食管下
16、段管壁外的血管主要有食管周围静脉和食管旁静脉，均起始于胃冠状静脉。食管周围静脉有多支，分布于食管壁的周围；食管旁静脉其实就是胃冠状静脉的食管支、高位食管支，距食管壁约0 5 c m 的距离平行于食管上行，其左侧发出4 “ - - 6 支穿支静脉，呈阶梯状上下排列和分层次前后分布，且垂直状进入食管壁，并与食管壁内的静脉丛相连。食管旁静脉向上穿过食管裂孔进入胸腔，与胸腔食管旁静脉相连，然后经奇静脉回流入下腔静脉。选择性贲门周围血管离断术和经典的贲门周围血管离断术的主要区别，就在于保留食管旁静脉，仅离断其进入食管壁的穿支静脉。这样既能阻断腹腔段食管的反常血流，又可维持机体的自发性分流，降低门静脉的压力。本实验中B 组犬术后6 月胃粘膜细胞灿
