《大肠癌肝转移的分子生物学和生物信息学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《大肠癌肝转移的分子生物学和生物信息学研究（91页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学博士学位论文大肠癌肝转移的分子生物学和生物信息学研究姓名：葛维挺申请学位级别：博士专业：生物信息学指导教师：郑树20060501浙* $ 博掌m 论文1 、S T l 42 、T T S P s3 、C U B4 、L D L R5 、S P6 、H A I 一17 、G S T8 、E C M9 、R U 毪1 0 、H G F S F1 l 、u P A1 2 、t P A1 3 、C G H本文常用英文缩略词S u p p r e s s i o no ft u m o r i g e n i e i t y1 4t y p eI It r a n s m e n b r a n
2、 c es e r i n ep r o t e a s e sC o m p l e m e n ts u b c o m p o n e n tC l r sL o wd e n s i t y1 i p o p r o t e i nr e c e p t o rs e r m ep r o t e a s eH e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o ra c t i v a t o ri n h i b i t o r 一1g l u t a t h i o n e S - t r a n s f e r a s eE x t r ac e l l
3、 u l a rm a t r i xP r o t e i n a s e a c t i v a t e dr e c e p t o r2H e p a t o c y t eg r o w t hf a c t o r s c a t t e rf a c t o rU r o k i n a s e t y p ep l a s m i n o g e na c t i v a t o rT i s s u ep t a s m i n o g e na c t i v a t o rC o m p a r a t i v eg e n o m i ch y b r i d i z
4、a t i o n1 4 、q R T - P C Rq u a n t i t a t i v er e a l t i m eP C R1 5 、P M S F1 6 、G S E A1 7 、S V Dp h e n y l m e t h y l s u l f o n y lf l u o r i d eG e n es e te n r i c h m e n ta n a l y s i sS i n g u l a rv a l u ed e c o m p o s i t i o n s1 8 、S E L D I T O F M SS u r f a c ee n h a
5、n c e dl a s e rd e s o r p t i o n J i o n i z a t i o nt i m e o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y* n $ 镕_ 士掌位* 戈1 9 、n s W2 0 、n g W2 1 、qv a l u e2 2 、c o l N N2 3 、C 0 1 T T2 4 、M e t M2 5 、L i v N L对样本做校正后的秩和检验统计量对基因做校正后的秩和检验统计量校正后的差异显著性评价正常肠上皮组织大肠癌原发灶组织大肠癌肝转移灶组织正常肝组织2浙 学m # m * 文大
6、肠癌肝转移的分子生物学和生物信息学研究- - I ：转移相关基因S T l 4 互作蛋白和相关基因的分子生物学研究- - I I ：染色体、信号通路和基因表达谱数据的生物信息学整合分析摘要第一部分：转移相关基因S T l 4 互作蛋白和相关基因的分子生物学研究大肠癌( C o l o r e c t a lC a n c e r ，C R C ) 是一常见的恶性肿瘤，我国大肠癌的发病率日渐增高，已跃居第3 5 位。而在大肠癌远处转移中，肝脏是最主要的转移部位。1 5 2 5 的大肠癌患者在确诊原发灶时发现肝转移，2 0 左右的患者原发灶治疗后出现肝转移2 ，”。在大肠癌死亡病人的尸检中可以发现
7、3 6 8 1 的肝转移1 4 1 。大肠癌的肝转移涉及了从侵袭细胞外基质( E x t r aC e l l u l a rM a t r i x ，E C M ) 到最后癌细胞在肝脏中增殖的多个过程，一系列的基因和蛋白参与其中。S T 4 基因自发现起就因其具备降解细胞外基质的能力而被认为与肿瘤的转移相关，一方面不同的肿瘤组织中该基因的表达情况高低不一，在大肠癌组织中S T l 4 基因不表达或低表达f 5 】而在其他一些肿瘤组织中，如乳腺癌、卵巢癌和宫颈癌中高表达 6 8 j 。另一方面该基因的蛋白自身具有多种存在形式，并已发现了多个与其作用的蛋白，抑制该蛋白的酶活性，如H e p a
8、t o c y t eg r o w t hf a c t o rA c t i v a t o rI n h i b i t o r - 1 ( H A l 1 ) 和A p r o t i n i n 蛋 白，或者被该蛋白酶激活，如蛋白酶活化受体2 ( P r o t e i n a s e A c t i v a t e d R e c e p t o r 2 ，龇)以及肝细胞生长因子，扩散因子( H e p a o c y t eG r o w t hI Z a c t o r S c a t t e rF a c t o r ，H G F S F ) 的前体和尿激酶型纤溶酶原激活因子
9、( u r o k i n a s e t y p eP l a s m l n o g e nA c t i v a t o r ，u P 舢的前体。S T l 4 蛋白包括了一个N 端的穿膜区( t r a n s m e m b r a n er e g i o n ，T M ) ，C 端的丝氨酸蛋白酶( s e f i n ep r o t e a s e ，S P ) 结构域，一个S E A 结构域，两个C U B ( c o m p l e m e n ts u b c o m p o n e n tC l f f s ) 结构域，四个L D L R ( 1 0 wd e n s
10、i t yl i p o p r o t e i nr e c e p t o r ) 结构域。该蛋白中包含的多个结构域在S T l 4 蛋白的激活与抑制过程中起到了重要作用【9 1 ，但具体机制尚不清楚。因此无论在基因水平寻找受S T l 4 基因表达影响的基因，或是在蛋白质水平寻找与S T l 4 蛋白结构域相互作用的蛋白，都对理解S T l 4 基因在肿瘤转浙 掌m 掌* X移过程中的作用机制有着很大帮助。第一部分研究工作为分子生物学分析，技术路线是：使用基囡芯片( M i c r o a r r a y )技术分析肠癌细胞系R K O 中S T l 4 表达相关基因，使用蛋白质相互作用
11、分析方法( G S TP u l lD o w n ) 寻找S T l 4 蛋白各个结构域的相互作用蛋白，构建S T l 4 蛋白各结构域相应突变体作为对照，寻找与S T l 4 相关的基因和相互作用的蛋白，分析S T l 4基因在肿瘤转移过程中的具体作用机制。第一部分的研究做了以下两个方面的工作：1 采用基因芯片( M i c r o a r r a y ) 技术，检测肠癌细胞系R K O 转染S T l 4 基囡前后基因表达谱变化，发现了S T l 4 基因的高表达导致了转移相关的整合索p 1 ( 1 T G B I ) 、基质金属蛋白酶l ( M M 2 1 ) 、M A L A T I
12、 、A P I S 3 等基因和氧化磷酸化通路( O x i d a t i v eP h o s p h o 刚a t i o nP a t h w a y ) 的上调。2 构建S T l 4 蛋白S P 、C U B 和L D L R 结构域的G S T 融合表达质粒，对各结构域做突变试验构建无生物学活性的突变体作为阴性对照，使用梯度洗脱方法改进G S TP u l lD o w n 技术，发现了新的与C U B 结构域相结合的蛋白T M E F F I( t r a n s m e m b r a n eD r o t e i nw i t hE G F 1 i k ea n dt w
13、of o l l i s t a t i n l i k ed o m a i n s1 ) ，荧光定量P C R 证实T M E F F I 和S T l 4 基因在大肠癌R K O 细胞系和肾癌组织中都存在共同上调的现象。第二部分：染色体、信号通路和基因表达谱数据的生物信息学整合分析大肠癌作为一种染色体不稳定的疾病，已有多个染色体区域的扩增或者缺失被证明与大肠癌的发生以及大肠癌的肝转移有关。染色体拷贝数的变化反映了基因和蛋白质水平的表达变化。而信号通路的信息反映了基因之间相互关系，位于同个信号通路中的基因一般直接或间接存在着相互作用。大肠癌的肝转移涉及了一系列基因表达的变化，这些基因必然定
14、位于某段染色体或属于某个信号通路，诸如S T l 4基因仅是与肿瘤转移相关的众多基因之一。从实验结果来看该基因的蛋白表达的生物效应取决于系列与其相关的激活抑制蛋白，而不是独立发挥作用。肿瘤疾病是复杂性状的多基因疾病，单单研究某个基因、蛋白或染色体的改变往往和肿瘤临床表型无法很好的联系。现有相关高通量技术，如比较基因组杂交( C o m p a r a t i v eg e n o m i c浙4 # * 学镕ih y b r i d i z a t i o n ，C G H ) 技术一次实验即可确定待测样本中整个基因组D N A 拷贝数增减 1 0 i ，基因芯片( M i c r o a n
15、 a y ) 技术能确定细胞内所有基因的表达谱，获得多个样本中成千上万个基因表达的模式 1 l - 1 3 。大肠癌原发灶和肝转移灶组织都积累了大量的基因表达谱数据和染色体拷贝数变化数据，应用生物信息学手段从更加整体的角度来研究大肠癌的肝转移，发现肝转移的相关信息已经成为可能。第二部分研究工作为生物信息学分析，技术路线是：对大肠癌原发灶和转移灶组织的基因芯片数据，应用奇异值分解( S i n g u l a r V a l u eD e c o m p o s i t i o n s ，S V D ) 的数学分析方法，整合染色体拷贝数改变的信息和基因芯片获得表达谱的数据分析；整合信号通路和基因
16、表达谱的数据分析，寻找新的与大肠癌肝转移相关的差异显著的染色体区带和信号通路，结合该相应位置肝转移的基因表达谱分析出贡献率大的最有意义的肝转移相关基因。筇二部分的研究做了下面两个方面的工作：1 对大肠癌原发灶与肝转移灶组织的基因表达谱数据，应用奇异值分解( S i n g u l a rV a l u eD e c o m p o s i t i o n s ，S V D ) 的数学分析方法，整合分析染色体区带和基因表达谱数据，对其中差异最显著的染色体区带4 q 2 2 ( 肝转移灶组织V S 原发灶组织) 与4 q 1 3 ( 原发灶组织V S 正常肠上皮组织) 的进一步分析证实了：染色体4 q 2 2 区域的基因在肝转移灶组织中高表达，其中主要贡献基因是骨桥蛋白( O s t e o p o n t i n ) ，该基因目前已有较多报道与大肠癌的肝转移关系密切【4 ”】：染色体4 q 1 3 区域的基因在原发灶组织中低表达，其中主要贡献基因是尿苷二
