急性等容血液稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100β蛋白及炎症因子的影响

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1、广州医学院硕士学位论文急性等容血液稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋 白及炎症因子的影响姓名：郑进申请学位级别：硕士专业：麻醉学指导教师：黄焕森20100501急性等容学院稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋白及炎症因子的影响 广州医学院硕士学位论文 3急性等容血液稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、 S-100 蛋白及炎症因子的影响急性等容血液稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、 S-100 蛋白及炎症因子的影响 专 业： 麻醉学 研究生： 郑 进 导 师： 黄焕森 主任医师 广州医学院第二附属医院麻醉科 中文摘要中文摘要 研究背景与目的 研究背景与目的 临床上颅内动脉瘤手

2、术时暂时阻断载瘤动脉、手术区域的脑组织牵拉、心肌梗死、休克、心跳呼吸骤停等均可造成脑组织缺血。脑细胞对缺血极为敏感，为了避免不可逆损害，必须及时恢复脑血流的灌注,而脑血流的重新灌注会导致再灌注损伤，即称之为脑缺血再灌注损伤（Cerebral Ischemia Reperfusion Injury，CIRI）。脑缺血再灌注所触发的一系列复杂的级联反应，包括线粒体损害、钙超载、兴奋性氨基酸毒性作用、自由基生成、蛋白酶激活、凋亡基因激活和炎症反应等。这些环节互为因果，彼此重叠，并相互联系，形成恶性循环，最终导致细胞凋亡。大量研究表明，细胞凋亡与脑缺血再灌注损伤有着密切关系。 急性炎症反应在再灌注所引

3、发的继发性脑损伤中起着关键作用。脑缺血再灌注时，氧自由基和其它信使激活炎性细胞因子和致炎症酶原引起趋化因子释放，粘附分子上调，白细胞和内皮细胞相互作用致白细胞粘附于血管内皮细胞阻塞微血管，导致微血管闭塞引发“无复流”现象。聚集的细胞释放氧自由基、蛋白水解酶及细胞激动素等直接损伤内皮细胞导致血脑屏障破坏，继发脑水肿、脑出血及神经元损伤。同时，活化的白细胞在微血管内聚集，又释放大量的炎性介质和细胞因子，吸急性等容学院稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋白及炎症因子的影响 广州医学院硕士学位论文 4引更多的中性粒细胞聚集、浸润，加重炎症反应，造成恶性循环。肿瘤坏死因子-在缺血再灌注损伤引起

4、的炎症反应过程中能促使白细胞粘附血管壁，并促进脑组织炎性细胞浸润，诱导白细胞介素和次级炎症介质的合成，具有重要的神经毒性作用。 急性等容血液稀释（Acute Normovolemic Hemodilution，ANH）是被大量研究所证实的一种有效的血液保护措施。ANH 可以改变机体的血液流变学，使全血粘度、血浆粘度、红细胞聚集指数、纤维蛋白原等降低，使组织血流灌注得到改善。另外，红细胞变形性增加，能很好通过微血管，从而改善组织的氧供。目前多数研究分析其具有器官保护作用也是基于血液流变学改变所产生的作用，但是其对缺血再灌注损伤后产生的炎症反应、神经元细胞调亡等的作用如何研究报道较少。 故此，本研

5、究拟通过建立实验兔大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血再灌注模型，应用羟乙基淀粉(Hydroxyethyl Starch，HES)130/0.4（万汶）实施急性等容血液稀释处理，观察 ANH 对兔脑缺血再灌注后炎症因子的表达、血清 S-100 蛋白含量及神经细胞凋亡的影响， 评估 ANH 处理对脑缺血再灌注损伤的作用， 并探讨其可能机制，为临床应用提供理论依据。 方方 法法 12周龄新西兰大白兔24只(由广东省实验动物中心提供)，雌雄不限，体重2.30.2 kg。随机数字表法分为3组，假手术组（S组，n=8）; 缺血-再灌注组（IR组，n=8）; 血液稀释-缺血-再灌注组（HIR组，n=8） 。S组只分

6、离颈总动脉与颈外动脉；IR组和HIR组参照Zea Longa线栓法制作兔大脑中动脉缺血再灌注模型，Longa评分法对兔进行神经行为学评分。血液稀释组从右股动脉放血，同时从股静脉补入等容量6%羟乙基淀粉130/0.4，20min内完成，稀释目标Hct值为30%。缺血时间2 h。三组分别于缺血前30min(To)、 再灌注即刻(T1)、 再灌注3h(T2)、 再灌注6h (T3)、 再灌注24h(T4) 用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)测颈静脉血清IL-1、IL-6、TNF-、S-100含量。再灌注24h后处死兔，应用末端脱氧核糖

7、核酸转移酶标记(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, Tunel)染色方法观察脑组织神经细胞凋亡情况。 急性等容学院稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋白及炎症因子的影响 广州医学院硕士学位论文 5结结 果果 1. 神经细胞凋亡计数：IR组与HIR组神经细胞凋亡计数明显多于S组，与S组比较差异均有统计学意义(P0.05)。与T0比较，IR组和HIR组在T1T4时的血清S-100浓度明显高于T0时(P0.05)；与T0时比较，IR组和HIR组在T1T4时的血清TNF-、IL-1、IL-6浓度明显高于T0时(P0.05).；Compared to T0

8、, the concentration of serum S-100 increased at T1T4 in IR group and in HIR group(P0.05).Compared to T0, the concentration of serum TNF-, IL-1 and IL-6 were increase at T1T4 in IR group and in HIR group(P0.05)。与T0比较，IR组和HIR组在T1T4时的血清S-100浓度明显高于T0时(P0.05)；与T0时比较，IR组和HIR组在T1T4时的血清TNF-、IL-1、IL-6浓度明显高于T

9、0时(P0.01或P0.05)；在T1T4时间点,IR组和HIR组的血清TNF-、IL-1、IL-6浓度均明显高于S组 (P0.01或P0.05)；在T2T4时间点, 血清TNF-、 IL-1浓度IR组和HIR组组间比较差异有统计学意义(P0.05)。 在T1T4时间点, 血清IL-6浓度IR组和HIR组组间比较差异有统计学意义(P0.05)。 详见表3-5， 图6-8。 表 1 TUNEL 染色结果 组别 阳性细胞核总数(个) S 组 42.886.79 IR 组 127.138.11 HIR 组 727.46# 注：与S组比较： P0.05，P0.01；HIR组与IR组比较：# P0.05

10、。 表 2 各组不同时间点 S-100的变化 S-100(ng/ml) 分组 T0 T1 T2 T3 T4 S组 0.010.01 0.020.01 0.020.01 0.020.01 0.040.01 IR组 0.020.02 0.210.03* 0.530.05* 0.660.21* 1.070.37* HIR组 0.020.01 0.110.02* # 0.260.05* # 0.300.08* # 0.600.11* # 注： 组内与 TO比较：*P0.01;HIR 组、 IR 组与 S 组比较：P0.01； HIR 组与 IR 组比较：#P0.05。 1 9急性等容学院稀释对兔脑缺血

11、再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋白及炎症因子的影响 广州医学院硕士学位论文 20表 3 各组不同时间点 TNF-的比较 TNF-（ng/l) 分组 T0 T1 T2 T3 T4 S组 54.354.37 65.382.76 73.623.47 76.763.52 80.703.57 IR组 55.104.29 103.7218.46* 154.6624.04* 203.2226.39* 272.8136.27*HIR组 54.934.48 89.8113.27* 103.5112.39*# 110.4718.27*# 157.1923.01*# 注：组内与TO比较： *P0.05，* P0.0

12、1;HIR组、IR组与S组比较：P0.05，P0.01；HIR组与IR组比较：#P0.05。 表 4 各组不同时间点 IL-1 的比较 IL-1(ng/l) 分组 T0 T1 T2 T3 T4 S组 283.1720.77 290.2717.93 314.2724.37 335.6229.84 352.1533.62 IR组 282.7320.44 502.1742.49*749.8572.62* 894.4198.71* 1027.43148.71*HIR组 287.2420.71 417.7330.75*506.5257.24*# 567.1763.34*# 685.3687.85*# 注

13、：组内与 TO比较： *P0.05，* P0.01; HIR 组、IR 组与 S 组比较：P0.05，P0.01；HIR 组与 IR 组比较：#P0.05。 表 5 各组不同时间点 IL-6 的比较 IL-6(ng/l) 分组 T0 T1 T2 T3 T4 S组 248.2714.31 292.9412.67 350.3815.63 391.8217.42 417.3416.37 IR组 247.1313.27 453.6233.28* 562.3753.89* 667.2864.30* 802.7476.87*HIR组 243.2812.36 354.1220.24*#460.1231.37

14、*# 564.3845.27*# 612.6459.93*# 急性等容学院稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋白及炎症因子的影响 广州医学院硕士学位论文 21注：组内与 TO比较： *P0.05，* P0.01; HIR 组、IR 组与 S 组比较：P0.05，P0.01；HIR 组与 IR 组比较：#P0.05。 图 1 假手术组（S组）40 图 2 缺血-再灌注组(IR组）40 图 1 假手术组（S组）40 图 2 缺血-再灌注组(IR组）40 图 3 血液稀释-缺血-再灌注组（HIR组）40 图 3 血液稀释-缺血-再灌注组（HIR组）40 各组神经细胞凋亡计数比较020406

15、080100120140160S组HIR组IR组 组别tunel阳性细胞计数（个） #图 4 各组神经细胞凋亡计数 急性等容学院稀释对兔脑缺血再灌注神经细胞凋亡、S-100蛋白及炎症因子的影响 广州医学院硕士学位论文 22注：与S组比较： P0.05，P0.01；HIR组与IR组比较：# P0.05。 各组S-100在不同时间点的浓度00.20.40.60.811.21.41.6T0T1T2T3T4 时间点S-100（ng/ml）S组 IR组 HIR组* #* * * * * #* #* #图 5 各组不同时点血清 S-100浓度比较 注： 组内与 TO比较： *P0.01;HIR 组、IR 组与 S 组比较：P0.01； HIR 组与 IR 组比较：#P0.05。 050100150200250300350T0T1T2T3T4 时间点血清TNF-浓度（ng/l）S组 IR组 HIR组* * * * #* #* * * #* * 图 6 各组不同时点血清 TNF-比较 注