《PLK1特异性抑制剂对肾上腺皮质癌细胞SW13增殖的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《PLK1特异性抑制剂对肾上腺皮质癌细胞SW13增殖的影响（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fM a s t e rT h ee f f e c to fP L K li n h i b i t o ri nt h ep r o l i f e r a t i o no fa d r e n o c o r t i c a lc a r c i n o m aS W l 3c e l ll i n eB yZ h a oS h i m i n gS u p e r v i s o r ：P r o f Y
2、 a n gJ i n ji a nC l i n i c a lM e d i c i n eU r o l o g yT h eF i r s tA f f i l i a t e dH o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yA p r i l ，2 0 1 2原创性声明! 1 1 1 1 111I I1 1 1 1 1tI II l l I tU I Y 2 10 2 2 3 7本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表
3、或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 位论文作者：他阳砑日期：k J 饽J 月7 日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密
4、论文在解密后应遵守此规定。 学位论文作者：龀归码日期：J 诲心月Z7 画摘要P L K l 特异性抑制剂对肾上腺皮质癌细胞S W l 3 增殖的影响研究生赵世明导师杨锦建郑州大学第一附属医院泌尿外科中国郑州4 5 0 0 5 2摘要目的采用免疫组化的方法检测P l k l 在肾上腺皮质肿瘤中的表达情况，通过不同浓度P l k l 靶向分子抑制剂B I2 5 3 6 对肾上腺皮质癌S W l 3 细胞株体外培养进行干预，探讨B I2 5 3 6 对S W l 3 细胞增殖的影响，探讨将P l k l 作为肾上腺皮质癌新治疗靶点的可能。材料和方法收集郑州大学第一附属医院1 9 9 0 年1 0 月
5、到2 0 1 0 年1 0 月来手术获取的肾上腺皮质肿瘤石蜡标本5 6 例，其中肾上腺皮质癌1 5 例，肾上腺皮质腺瘤4 1 例，免疫组化检测P l k l 的表达情况。7 对肾上腺皮质癌细胞株S W l 3 进行体外培养，待细胞生长进入对数期后，在细胞培养液中加入不同浓度B I2 5 3 6 ，使药物终浓度分别为5 ，1 0 ，2 0 , 4 0 ，6 0 嵋L ，在药物作用4 8 小时后，倒置显微镜观察药物干预后S W l 3 细胞生长及形态变化，M I q “ 细胞增殖检测的方法测定吸光度后计算B I2 5 3 6 对S W l 3 细胞生长的抑制率。结果1 P l k l 在肾上腺皮质
6、癌中的阳性表达率( 7 3 1 1 ) 高于肾上腺皮质腺瘤( 2 9 2 7 ) ，两者阳性表达率之间差异具有统计学意义( P 5 c m ，T 3 任何大小肿瘤、局部侵犯、但不累计临近器官，T 4 任何大小肿瘤、累计临近器官；N O 无区域淋巴结转移，N 1 区域淋巴结转移；M 0 无远处转移，M 1 远处转移。依据瘤体大小、局部侵犯情况和区域淋巴结转移定义I I I 期，临近器官侵犯者或存在远处转移定义为期。半数以上的肾上腺皮质癌患者存在内分泌紊乱症状，其中以皮质醇增多症伴男性化最为常见，非功能性肾上腺皮质癌则多表现为消瘦、低热、恶心、食欲不佳、腹部胀痛等。近半数肾上腺皮质癌患者可触及腹部
7、肿块，也有部分患者表现为咯血、病理骨折等转移症状。肾上腺皮质癌的诊断需结合临床表现、影像学结果、大体、镜下组织形态及免疫组化结果，目前国际上推荐W e i s s肾上腺皮质癌组织学诊断标准，其内容包括核分裂指数 5 5 0 H P 、不典型核分裂、核异型性大小、静脉侵犯、肿瘤坏死、肿瘤细胞呈弥漫分布、窦状样结构浸润、包膜浸润等，其中患者的预后同肿瘤细胞浸润和核分裂指数的关系最为紧密。3 0 8 5 的肾上腺皮质癌患者诊断时已存在远处转移，其中大部分生存时间不超过1 年；手术后结合放化疗治疗I I I I 期患者5 年生存率则不足3 0 ，目前尚缺乏对肾上腺皮质癌行之有效的治疗手段。肾上腺皮质癌
8、治疗效果不佳、预后不良，促使各国泌尿外科学者对其进行日U 青更加深入的研究。随着肾上腺皮质癌分子机制的深入研究和分子靶向药物的广泛研制，新的分子靶向治疗可能为肾上腺皮质癌患者带来新的希望。本研究通过免疫组化的方法检测了P l k l 在肾上腺良恶性肿瘤中的表达情况，而后进一步采用P l k l 特异性靶向分子抑制剂B I2 5 3 6 对肾上腺皮质癌细胞株S W l 3 进行体外培养干预，采用倒置显微镜观察和M T T 细胞增殖测定的方法进行检测，探讨B I2 5 3 6 对S W l 3 细胞体外增殖的影响，探索将P l k l 作为肾上腺皮质癌新治疗靶点的可能。材料与方法l 材料1 1 主
9、要试剂和实验对象P l k l 靶向分子抑制剂B I2 5 3 6P l k l 兔抗人多克隆抗体两步法免疫组化试剂盒D A B 显色剂胎牛血清胰蛋白酶P B S 缓冲液M T I “ 干粉L 1 5 培养基D M E M 高糖培养基二甲基亚砜肾上腺皮质癌S W l 3 细胞株1 2 主要实验设备生物安全台细胞培养箱分光光度计倒置显微镜低温高速离心机超纯水设备电热恒温水浴箱恒温电烤箱材料与方法由美国哈佛大学麻省总医院肉瘤分子教研室主任段振峰教授惠赠美国S a n t aC r u z 生物公司武汉博士德生物公司北京中杉金桥生物公司美国H y c l o n e 生物公司上海碧云天生物公司广州吉
10、诺生物公司上海碧云天生物公司上海碧云天生物公司上海碧云天生物公司上海生工有限公司购自上海中科院细胞所北京森雷普实验器械公司美国l 迮v C O 公司美国通用( G E ) 公司德国徕卡( L E I C A ) 公司美国贝克曼( B e c k m a n ) 公司美国密理博( M i U i p o r e ) 公司上海精宏公司上海新苗公司3材料与方法2 0 、4 冰箱6 孔板9 6 孔板2 5 m l 培养瓶实验计时器单道移液枪O 1 2 u l单道移液枪0 5 1 0 u l单道移液枪2 - 2 0 u l单道移液枪2 0 2 0 0 u l单道移液枪2 0 0 1 0 0 0 u l各
11、个规格枪头2 方法海尔公司美国康宁( C O R N I N G ) 公司美国康宁( C O R N I N G ) 公司美国康宁( C O R N I N G ) 公司武汉博士德生物有限公司百得( B i o h i t ) 中国分公司百得( B i o h i t ) 中国分公司百得( B i o h i t ) 中国分公司百得( B i o h i t ) 中国分公司百得( B i o h i t ) 中国分公司百得( B i o h i t ) 中国分公司2 1 免疫组化检测P l k l 在肾上腺皮质肿瘤中的表达情况收集郑大一附院近2 0 年来手术获取的肾上腺皮质肿瘤石蜡标本5 6
12、例，经病理确认其中肾上腺皮质癌1 5 例，肾上腺皮质腺瘤4 1 例，用于免疫组化检测，P l k l 一抗抗体以P B S 液稀释至1 ：1 0 0 ，免疫组化步骤依照两步法免疫组化试剂盒说明书进行，胞质黄染或胞质内黄色颗粒视为阳性染色，并同间质细胞进行比较，由我院2 名高年资病理科医师阅片判定结果。2 2S W l 3 细胞株的培养按照1 0 胎牛血清、4 5 L 1 5 培养基、4 5 D M E M 高糖培养基的比例，配置细胞完全培养基，用于对S W l 3 细胞的培养。细胞以4 x 1 0 5 m l 密度接种入无菌培养瓶内，待细胞生长基本铺满培养瓶后用胰酶传代或进行试验，细胞培养箱恒
13、温于3 7 度，培养时适当拧紧培养瓶瓶口，维持培养基适度偏碱环境，P H 值保持于7 5 。当所培养的S W l 3 细胞对数生长达到所需密度后用于实验或收集冻存留以备用。2 3 倒置显微镜观察S W l 3 细胞形态和生长情况6 孔板中以4 x 1 0 5 m l 密度接种S W l 3 细胞，继续培养8 h 后使细胞贴壁生长，4材料与方法加入不同剂量的B I2 5 3 6 和新鲜完全培养基，使最终药物浓度为5 ，1 0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 鹏几同时设立阴性对照孔，培养4 8 h 后细胞换液，倒置显微镜观察、拍摄不同药物浓度下细胞的生长情况。2 4M I I 法测定不同浓度B I2
14、 5 3 6 下S W l 3 细胞活力设立不同浓度药物组、阴性对照组、调零组。胰酶消化处于对数生长期的S W l 3 细胞，细胞计数板协助下调整细胞密度至4 x 1 0 S m l 。在9 6 孔板接种细胞，每孔加入吹打均匀的细胞悬液1 0 0 I - t l 。3 7 度恒温培养箱中培养细胞4 h ，加入不同浓度的B I2 5 3 6 或完全培养基，使最终药物浓度分别达到5 ，1 0 ，2 0 ，4 0 ，6 0 烬L ，每孔终末体积2 0 0 I _ t l ；阴性对照组中每孔加入完全培养基1 0 0 u l ，每孔终末体积2 0 0 1 x l ；调零组，未予以细胞接种的孔中加入完全培
15、养基2 0 0 I t l 。每实验组均设5个复孔，结果取平均值。培养4 8 h ，每孔加入3 0 u l 新鲜配制的1 0 M T r ，继续培养4 h ，用酶标仪测定波长为4 9 2 n m 时各孔的O D 值 D ( 4 9 2 ) 1 ，用调零孔进行调零。各实验组取5 个复孔取平均值，抑制率( ) = 1 实验组D ( 4 9 2 ) 1 I 羽性对照组D ( 4 9 2 ) x 1 0 0 。M T r 实验依上述进行重复5 遍。2 5 实验数据处理采用S P S S l 7 0 统计软件进行统计学实验数据处理，所得到实验数据，采用均数士标准差( x 5 ) 来表示。采用卡方检验分析
16、免疫组化结果，采用单因素方差分析比较不同药物浓度组所得M T r 数据。以P 0 0 5 ) 。表明B I2 5 3 6 可有效降低肾上腺皮质癌S W l 3 细胞增殖活力，当浓度达到4 0 嵋L 时，生长抑制作用达到最大( 见附表) 。6结果对照组B I2 5 3 6 ( p g L )5 1 0 宰拳2 0 + 宰宰幸0 5 7 3 O 0 8 600 4 9 7 o 0 3 31 3 3 2 10 4 2 8 0 0 3 62 5 4 - + 2 90 3 7 1 o 0 4 23 5 3 3 04 0 + 难事事0 3 0 2 0 0 2 84 7 3 1 96 0 宰幸0 3 1 1 O 0 3 14 5 8 2 8不同数目“ 组间比较差异有统计学意义( P 0 0 5 )7讨论讨论抗细胞有丝分裂是治疗白血病和多种恶性实体肿瘤的常用方法。但是i 传统的此类抗
