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1、华中科技大学硕士学位论文单壁碳纳米管颗粒对大鼠心血管系统的影响及其机制姓名：李芬申请学位级别：硕士专业：生理学指导教师：刘烈炬20080501独创性声明独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已标明引用的内容外，本论文不包含任何其他人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：李芬 日期：2008 年 5 月 20 日 学位论文版权使用授权书学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定
2、，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密，在_年解密后适用本授权书。 本论文属于 不保密。 （请在以上方框内打“” ） 学位论文作者签名：李芬 指导教师签名： 刘烈炬 日期：2008 年 5 月 20 日 日期：2008 年 5 月 20 日 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 1单壁单壁碳纳米管颗粒对大鼠心室肌细胞钠电流的影响 纳米管颗粒对大鼠心室肌细胞钠电流的影响 摘 要
3、 目的： 研究单壁碳纳米管颗粒对大鼠心室肌细胞钠电流的影响， 探讨其作用机制。 方法：运用全细胞膜片钳技术在成年大鼠心室肌细胞记录钠通道电流。实验分为空白对照组，不同浓度实验组。 结果：单壁碳纳米管颗粒（0.01mg/ml;0.03mg/ml;0.1mg/ml）可浓度依赖性增加心室肌细胞钠通道电流。0.01mg/ml SWNT增加率为(12.343.56)%，0.03mg/ml SWNT增加率为(31.454.25)%， 0. 1mg/ml SWNT增加率为(52.364.56)% ( n = 8每组) 。 结论：单壁碳纳米管颗粒可浓度依赖性的增加大鼠心室肌细胞钠通道电流，可能是导致心律失常的
4、机制之一。 关键词 全细胞膜片钳技术；钠通道电流；心室肌细胞 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 2Effect of SWNTs on sodium current in rat ventricular myocytes Abstract AIM: To study the effect of SWNTs on sodium current in SD rats ventricular myocytes, and explore the possible mechanisms underlying them. METHODS: the whole-cell
5、 patch-clamp techniques were used to record INa in isolated ventricular myocytes from SD rats. Effects of SWNTs(Respectly) on ventricular myocytes. RESULTSL: SWNTs increased the amplitude of whole cell INa by concentration -dependent manner. 0.01mg/ml SWNTs activted INa by (12.343.56)%,0.03 mg/ml SW
6、NTs activted INa by (31.454.25)%，0.1 mg/mlSWNTs activted INa by (52.364.56)% ( n = 8,respectly) . CONCLUSION: SWNTs decreased the amplitude of whole cell INa by concentration -dependent manner. This results the mechanism of arrhythmia. Key words : whole-cell patch clamp technique; sodium channels; v
7、entrcular myocyte 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 3前 言 粉尘（particle matter）是指能较长时间漂浮于工作场所空气中的固体微粒，其成分复杂，生物效应多样，正在成为危害人类健康的主要环境因素之一。世界卫生组织（WHO,World Health Organization）2002 年报告中指出，在全球范围内，城市空气中污染导致了 5%的支气管肺癌死亡率，2%的心肺疾病死亡率，以及 1%的呼吸系统感染的死亡率（World Health Organization，2002） 。 不同来源的粉尘颗粒物由于形成条件不同, 其粒径分布
8、、化学组成也大不相同。1987年，制定的标准从测量空气中总的悬浮微粒改为能够在支气管中沉积的微粒（PM10， PM直径10m） 。 1997， US EPA 发布了PM2.5的标准 （PM直径2.5m） ，其大小能达到终末支气管及肺泡。另外, 空气动力学直径 0. 1m的颗粒物又称为超细颗粒物, 因其粒径小, 潜在健康危害更大。纳米科技是一个方兴未艾的科技领域，广泛应用于美容，补牙，电池，催化剂行业。它的毒理作用及对环境污染的直接或间接影响，到目前还没有完全研究清楚。本课题讨论纳米级颗粒成员之一的 单 壁 碳 纳 米 颗 粒 ， 其 理 化 性 质 是 ： 单 壁 碳 纳 米 管 颗 粒 （
9、single -walled nanotubes,SWNTs），主要成分为碳，管径0.7-1.5nm，长度大于1m。此大小可以通过呼吸道系统直接进入心血管循环系统（Robert D,2004）。在传统医学界已达到共识的是空气中污染物 （包括空气中颗粒物） 可以通过肺部， 产生肺部炎症，引起一系列全身反应。 肺作为始动因素已经很清楚， 但是很多流行病学研究发现，短时间暴露在颗粒物中也可引起突发的心血管疾病， 而且原有心衰或心律失常的病人对大气颗粒物更加易感， 于是科学界提出了尘源性肺外炎症， 当粉尘颗粒 （特别是直径小于2m 的粉尘）吸入体内，不仅聚集于肺部，而且可通过血液循环聚集于心脏、脑以及
10、其他组织，用锝99双标记法发现超细微炭粒能够迅速吸入进入血液循环。这样就提供了粉尘颗粒直接作用于心肌细胞的可能性。因此我们设想，如果粉尘能够直接作用于心脏组织，其作用如何，机制如何，如果直接到达心肌细胞，会引起急性损伤及其生理学怎样的改变？科学界已经认识到纳米颗粒的毒性， 因为它华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 4们的结构与石棉相似，而且已经有肺部疾病的报道（Roberta Brayner.2008）也可导致心脏的QT间期，APD（动作电位时程） ，HR等都有明显影响,这可能导致心肌内离子通道电流的改变。根据上述证据和假说我们运用膜片钳技术，在细胞水平上直
11、接观测纳米颗粒对心室肌细胞电流的影响。 本实验用全细胞膜片钳方法在细胞水平观测碳纳米颗粒对心肌细胞钠电流的影响， 以便在细胞水平找到生物学特点。 材料与方法 一，材料 1.1 实验动物 健康成年大鼠，雌雄不拘，体重200220g。由华中科技大学同济医学部动物中心提供。 1.2 实验试剂 胶原酶型 (Collagenase type) Sigma公司 EGTA Sigma公司 4 氨基吡啶 Sigma公司 氯化铯 Sigma公司 氢氧化铯 Sigma公司 HEPES Sigma公司 河豚毒素(TTX) Sigma公司 ATP Na3H2O Sigma公司 牛磺酸(Taurine) 国产分析纯 单
12、臂碳纳米管颗粒 美国杜克大学化学系刘杰教授赠送 其它试剂均为国产分析纯 1.3 溶液配置 台式液成分（mmol/L）： NaCl 135， KCl 5.4， MgCl2 1， CaCl2 1.8， NaH2PO4 0.33， HEPES 10， Glucose 华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 510，用NaOH调pH值至7.4；无钙台式液为不含CaCl2的台式液；全细胞灌流液为含200mol/LCdCl2的台式液。 KB液成分（mmol/L）： KOH 70，KCl 40，MgCl2 3，KH2PO4 20，EGTA 0.5，L-谷氨酸 50， 牛黄酸
13、20，HEPES10，Glucose 10， 用KOH调pH值至7.4。 全细胞记录电极內液成分（mmol/L）： CsCl 120，CaCl21.0，MgCl2 5，Na2ATP 5，TEACl 10，EGTA 11，HEPES 10，用CsOH调pH值至7.3。 1.4 实验仪器 膜片钳AXON 200B放大器 美国AXON公司 Digidata 1322A数模转换器 美国AXON公司 倒置显微镜 日本Olympus公司 微电极拉制仪 美国Sutter公司 Burleigh微操纵仪（PCS-5000） 美国Burleigh公司 细胞灌流槽 美国杜克大学麻醉系 玻璃微电极（CAT.NO.G7
14、5150T-4） 美国Warner公司 计算机 国产 膜片钳数据采集及分析软件 pCLAMP 9.0 software (Axon Instruments) 二方法 2.1 细胞分离 单个大鼠心室肌细胞的制备 用2000个单位肝素腹腔麻醉，20分钟后腹腔注入苯巴比妥钠（50100mg/kg）麻醉。在4无钙台氏液中去周围组织后,固定在Langendorff灌流装置上,用无钙液经主动脉逆行灌流,整个灌流过程温度37,通以100% 氧气使灌流液饱和,灌流压约70 cmH2O。5min后转换成用含胶原酶I (0.1g/L)，蛋白酶（0.01g/L）和牛血清白蛋白(0.5 g/L)的无钙液灌流810分钟, 接着用KB液灌流5分钟后取下心脏，剪下心室肌并在KB液中剪碎，依次过滤3杯，华华 中中 科科 技技 大大 学学 硕硕 士士 学学 位位 论论 文文 6取第二杯或第三杯细胞悬液于室温下静置至少一小时后用于实验。 符合国际实验动物使用指南。 2.2 电流记录 整个实验在室温（212）进行。将细胞悬液滴入倒置显微镜工作台上的细胞灌流槽，待细胞贴壁后用通氧
