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1、兰州大学硕士学位论文胎儿皮肤和增生性瘢痕组织内基质金属蛋白酶及其抑制因子表 达变化的研究姓名：李文娟申请学位级别：硕士专业：病理与病理生理学指导教师：朱任之;付小兵20060601兰州大学硕士学位论文胎儿皮肤和增生性瘢痕组织内基质金属蛋白酶及其抑制因子表达变化的研究中文摘要目的：研究基质金属蛋白酶( M M P s ) 和基质金属蛋白酶组织抑制因子( T I M P s )在不同发育时期的胎儿皮肤和不同形成时期的增生性瘢痕中基因表达和蛋白含量、分布的变化，探索无瘢痕愈合发生机制以及增生性瘢痕发生和成熟的部分机制。方法：胎儿皮肤因创伤等意外因素终止妊娠的胎儿背部全层皮肤，共1 8例，胎龄饵6 A
2、 ) 1 3 3 3 周。标本按胎龄分为3 组，即早期( 1 3 1 9 周) ，中期( 2 1 - 2 5周) 和晚期( 2 7 3 3 周) ，每组6 例。增生性瘢痕组织取自进行整形手术患者的增生性瘢痕1 6 例，平均年龄为2 6 岁，伤口愈合的时间为4 月。1 1 年。瘢痕增生时间1 年以内8 例，1 2 年4 例，2 年以上4 例。正常对照组皮肤8 例，取自病人供皮区的全层皮肤。标本经无菌取材后，一部分立即液氮冻存，用于进行逆转录一多聚酶链反应( R T - P C R ) 和W e s t e r nb l o t 实验，检测M M P 一1 ，M M P 2 ，M M P 3 ，M
3、 M P 一7 ，M M P 一9 ，M M P 一1 4 ，T I M P 1 ，T I M P 2 和T I M P 一3 基因表达和蛋白含量的变化：另一部分标本经1 0 中性甲醛液固定，脱水，石蜡包埋后切片，用于免疫组化实验，镜下观察。结果：1 在早期妊娠胎儿皮肤中M M P 1 ，M M P 2 ，M M P 一3 ，M M P 7 ，M M P 9及M M P 1 4 的基因表达和蛋白含量均较低，随着胎龄的增加，表达水平逐渐升高，在妊娠晚期皮肤中这些基因的m R N A 和蛋白含量都显著增强( 尺O 0 5 ) 。T 1 M P 2 和T I M P 3 的基因表达和蛋白含量呈相同的
4、变化趋势，随着胎儿皮肤不断发育而逐渐升高。在不同妊娠时期的胎儿皮肤中，T I M P 1 基因表达变化不显著，但蛋白含量水平则逐渐增大，在妊娠晚期皮肤内含量明显高于妊娠早期( P ( 0 0 5 ) 。2 在正常皮肤组织内，M M P s 和T I M P s 的基因表达较弱，蛋白含量较低，蛋白阳性颗粒主要分布于表皮基底层细胞和少量的成纤维细胞中；在增殖期的瘢痕中M M P s 和T I M P s 基因和蛋白表达都显著升高( P 0 0 5 ) ，在胎儿不同发育时期，皮肤组织内M M P 3 基因表达量都高于M M P 1 ( 表1 - 3 1 。2 2M M P - 2 和M M P 9
5、基因在不同发育时期的J 台J L 皮肤组织内表达的变化M M P 2 和M M P 一9 都属于明胶酶类，主要水解底物为变性胶原和细胞外基质的主要成分型胶原和V 型胶原等。如图1 1 c 和1 1 D 所示M M P 一2 和M M P 9基因的t u R N A 经过R T - P C R 扩增后得到特异性的D N A 片段长度分另1 j 由2 1 0 b p 和6 3 3 b p 组成。在不同发育时期的J 台J L 皮肤组织内，这两种基因的表达变化规律相似。在早期妊娠胎儿皮肤中M M P 2 和M M P 9 基因表达水平都较低，随着胎儿兰州大学硕士学位论文发育和皮肤结构的逐渐成熟，这两种
6、基因表达水平逐渐升高，在妊娠晚期皮肤组织中，这两种基因表达水平分别是妊娠早期的2 4 和8 8 倍，基因表达量显著升高( 尸 o 0 5 ) 。3 、不同妊娠时期的胎儿皮肤组织内M M P s 和“ l i M P s 蛋白含量的变化规律3 1M M P ，1 和M M P 3 蛋白在不同发育时期的胎儿皮肤组织内含量的变化基因转录后要翻译成蛋白质才能够执行其生物功能。如图1 - 2 A ，1 - 2 B 所示，在不同发育时期的胎儿皮肤组织内M M P 1 和M M P 3 呈相似的表达变化规律。在早期妊娠胎儿皮肤内M M P 一1 和M M P 3 蛋白含量较低，在妊娠中期胎儿皮肤内M M P
7、 1 的蛋白含量升高，并持续到妊娠晚期；与妊娠早期相比，M M P 一3 蛋白兰 I 大学硕士学位论文在妊娠中期升高不明显，而妊娠晚期该蛋白含量是妊娠早期的1 3 倍，蛋白表达显著升高( P ，基质溶素3 ( M M P 。1 1 ) ，它们的水解底物较广泛，) N i l 、I V 、V 型胶原，明胶，蛋白聚糖以及糖蛋白等；膜型基质金属蛋白酶( m e m b r a n et y p e M M P s ，M T - M M P s ) ：包括I 膜型基质金属蛋白酶( M M P 1 4 ) ，I I 膜型基质金属蛋白酶( M M P 1 5 ) ，I 川摸型基质金属蛋白酶( M M P
8、，1 6 ) ，I V 膜型基质金属兰州大学硕士学位论文蛋白酶( M M P 一1 7 ) 。研究发现，M M P 1 4 和M M P 1 6 可激活M M P 2 ；其他：基质溶解因子( M M P 7 ) ，金属弹力蛋白酶( M M P 一1 2 ) ，酸性金属蛋白酶( M M P 6 ) ，釉质溶解素( M M P 2 0 ) ，P A S I 一1 ( M M P 一1 9 ) 。其中M M P 7 水解底物较广泛，如可以降解蛋白聚糖、明胶、型胶原等。已有研究发现，E C M 除了支持组织细胞外，还有复杂的信号传导和功能调节等作用，在胎儿创面无瘢痕愈合中起着重要的作用【2 5 , 2
9、 6 l 。因此本研究探讨了M M P s 超家族中6 种不同类型的M M P s 及其3 种抑制因子T I M P ，1 ，2 ，3 在妊娠早期、中期和晚期胎儿皮肤组织中基因转录、蛋白含量及其分布的变化规律，揭示胎儿无瘢痕愈合发生机制的部分奥秘。研究结果显示，在不同发育阶段胎儿皮肤组织内M M P 1 ，2 ，3 ，7 ，9 ，1 4 基因和蛋白都有表达，并且它们在皮肤组织内的分布规律相似。这显示不同类型的M M P s 蛋白可能都参与调控皮肤的生长发育、表型和功能的维持以及损伤后的修复，另外这些蛋白也可能参与毛囊和汗腺等皮肤附件的发生和成熟。例如，在汗腺发生过程中，汗腺胚芽细胞或汗腺细胞均
10、可以合成与分泌M M P 一2 和M M P 7 。随着汗腺发生并逐渐成熟，合成与分泌能力不断提高。在M M P s 的作用下，局部E C M 发生降解，引导分化方向己确定的原基细胞向汗腺胚芽细胞分化的同时，向表皮深层长入，裂解了基底膜区的主要成分纤维母细胞及维系真表皮连接的锚状纤维的主要构成物，汗腺胚芽细胞突破了基底膜区向真皮层切入【2 7 1 。另外值得注意的是，本研究还发现，许多M M P s 都是由结缔组织细胞自身合成和分泌的，因而在某些情况下细胞源自主调节机制可能显得很重要。M M P s 基因表达和蛋白合成受许多因素的调控，其中最重要的是细胞生长因子。多种生长因子都可促进M M P
11、 s 的表达和合成，其中包括表皮细胞生长因子( E G F ) ，血小板源性生长因子( P D G F ) ，碱性成纤维细胞生长因子( b F G F ) ，自介素一l a ( 1 L - l a ) N 2 8 30 1 。如I L l a 在创伤愈合中诱导M M P 1 表达，E G F 刺激M M P 3合成。T G F p 能够促进M M P 2 和T I M P s 表达，但抑制M M P 1 和M M P 3 表达与合成，表明T G F B 对M M P s 不同成员有不同的作用，这种不同的调节作用可能对组织的重塑和创面修复的精细调节有重要作用1 3 1 1 。另外，在大多数M M
12、 P s( 如M M P 一1 ，3 , 9 等) 基因的调节序列中含有T A r A 盒，在此T A T A 盒前存在许多转录调节因子结合位点，多种原癌基因如c - f o s 和c i u n 的表达产物能与这些位点相结合，刺激M M P s 的转录【3 “。P D G F 和b F G F 都能够促进成纤维细胞增殖和迁兰州大学硕士学位论文移，诱导细胞外基质的合成和沉积；E G F 与促进表皮细胞增殖，诱导创面快速上皮化有关，而c f o s 和c - j u n 蛋白相互结合形成转录因子A P 1 后，促进许多基因转录和蛋白表达，诱导细胞增殖和分化。l L 1 与细胞表面受体结合后，对角
13、质形成细胞、中性粒细胞和淋巴细胞有趋化作用，并能够刺激成纤维细胞合成胶原，影响创伤愈合的过程，过度表达可促进增生性瘢痕的形成 3 3 , 3 4 】。以往的研究结果显示，妊娠早期皮肤内P D G F 、b F G F 、E G F 、I L l 、C ，l o s 和C - j u n 蛋白低表达可能与创面无瘢痕愈合相关，而在妊娠晚期皮肤内蛋白这些蛋白因子高表达可能与创面愈合后形成瘢痕有关陋”I 。本研究发现，在早期妊娠J 台J L 皮肤组织中M M P s基因表达较弱，蛋白含量较低，随着胎儿生长发育，皮肤组织内这些基因表达逐渐增强，蛋白含量逐渐升高，在妊娠晚期皮肤内这些基因的m R N A
14、和蛋白含量都显著增大。在胎儿发育过程中，皮肤组织内M M P s 基因表达和蛋白含量的变化规律与创面愈合形成瘢痕的时相十分吻合，同时也与P D G F 等细胞因子和转录蛋白表达呈相似的变化趋势。因此在妊娠晚期的胎儿皮肤中，P D G F ，E G F ，b F G F和IL _ ln 与它们的受体特异性结合后，通过提高细胞内C 1 0 s 和C - j u n 蛋白含量和活性，诱导细胞内M M P s 蛋白表达，改变细胞局部微环境，促进新血管的形成和成纤维细胞增殖，导致肉芽组织过度增生形成瘢痕。细胞外基质是细胞存活的重要内环境，不仅含有胶原、糖蛋白和蛋白多糖等成分，而且还含有大量的细胞因子和粘
15、附分子等。妊娠晚期皮肤内M M P s 蛋白含量升高，促进细胞外基质降解的同时，加快或增加生长因子的释放和进出E C M的能力，改变细胞微环境，诱导成纤维细胞增殖和迁移。M M P s 蛋白还参与皮肤组织内新生血管的形成，促进毛细血管内皮层下基底膜的降解，诱导内皮细胞迁移和增殖，形成新的毛细血管。妊娠晚期皮肤内M M P s 基因表达和蛋自含量升高可能与诱导皮肤组织内毛细血管大量形成有关。T I M P s 是M M P s 的天然抑制剂，是一组能抑制M M P s 活性的多功能因子 3 8 】。T I M P s 分子包括2 个蛋白质结构域，其N 端结构域含有M M P s 抑制活性，C 端
16、结构域可能与明胶酶原的蛋白定位或复台物的形成有关。已发现四种T I M P s ，其中T I M P 1 ，2 ，4 为可溶性分泌蛋白，T I M P 一3 是一种结合E C M 的非可溶性蛋白。由于T 1 M P - 4 具有组织器官特异性，在成人心脏中有高水平表达，因此本研究没有对T I M P 一4 进行深入探讨。兰州大学硕士学位论文T I M P s 可以与M M P s 的酶原结合，形成稳定的复合物，并阻碍M M P s 酶原的自我激活，另外，T I M P s 还可以直接与活化的M M P s 形成紧密的1 ：1 复合物，从而阻断M M P s 与底物结合，是一种转录后调节机制。T I M P 1 能抑制绝大多数M M P s 的生物活性，可与M M P 9 前体及活化的M M P 一1 ，3 ，9 形成高度亲和的、非共价键结合的复合物，抑制它们的生物活性。T I M P 。2 与M M P
